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人类组织中TRAF3IP3基因表达的检测及转染胚肾HEK293细胞后的亚细胞定位
目的 克隆TRAF3IP3基因,明确TRAF3IP3在部分人类组织中的表达谱并鉴定其表达产物的亚细胞定位.方法采用实时定量PCR检测TRAF3 IP3基因在人体各组织中的表达情况；克隆TRAF3IP3基因开放读码框区(ORF)并构建真核亚细胞定位质粒.转染人胚肾HEK 293细胞,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位.结果 实时定量PCR证实TRAF3IP3基因在被检测的11种组织中均有表达,其中在淋巴结、脾、骨髓、胃和睾丸中的表达水平较高；成功克隆了TRAF3IP3基因ORF区并构建成为荧光定位质粒,激光共聚焦显微镜观察证实TRAF3IP3蛋白主要定位于核膜,在核周呈颗粒状分布.结论 TRAF3IP3基因在淋巴细胞富集的器官呈高表达,可能参与免疫系统的发育、成熟及调控,其表达产物在细胞内主要定位于核膜及核周胞浆.
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人TRAF3IP3基因的克隆及真核表达
目的 构建人肿瘤坏死因子受体相关因子3相互作用蛋白3(TRAF3IP3)基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定.方法 RT-PCR扩增获得TRAF3IP3开放读码框区基因,双酶切连入真核表达载体pIRES2-EGFP,双酶切和测序鉴定阳性克隆；重组质粒磷酸钙法转染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot法鉴定TRAF3IP3基因的表达情况.结果 经限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,成功构建了TRAF3IP3真核表达质粒,荧光显微镜观察可见转染了重组质粒的HEK293细胞有绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot结果证实TRAF3IP3蛋白高水平表达.结论 成功构建了pIRES-EGFP-TRAF3IP3真核表达质粒,为TRAF3IP3基因功能的研究奠定了基础.
