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铜绿假单胞菌噬菌体PaP3一个结构蛋白的N-端测序及编码基因的确定
目的确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3 的主要结构蛋白基因.方法将噬菌体PaP3颗粒用CsCl梯度离心纯化,S DS-PAGE电泳其结构蛋白后,电转印于PVDF膜上,再用Edman降解法对主要结构蛋白作N端测序,根据蛋白N端5个氨基酸残基序列逆推其编码读框.结果 PaP3主要结构蛋白的N端5个氨基酸残基顺序为:Ala-Thr-Pro-Thr-Asn.结论据此推定其编码基因为ORF 36 354～37 307 (负链)编码的蛋白,该蛋白共有318 氨基酸 ,其等电点为7.70,分子质量为35 024.46.
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嗜酸乳杆菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的分离纯化
目的 分离纯化嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 4356的3-磷酸甘油醛脱氢酶.方法 利用硫酸铵分级沉淀法、亲和层析、阴离子交换和分子筛层析对嗜酸乳杆菌GAPDH进行了分离纯化.通过N端测序鉴定了纯化产物;并用分子筛测定了嗜酸乳杆菌GAPDH的相对分子质量(Mr).结果 纯化产物在SDS-PAGE胶上呈现肘,为3.7×t04的单一条带,产量为0.9 ms/L(嗜酸乳杆菌培养物).N端测序结果证明纯化产物为嗜酸乳杆菌GAPDH.分子筛测定的GAPDH的肘,为7.08×104,表明嗜酸乳杆菌GAPDH是二聚体.结论 通过该纯化方案,可大量获得电泳纯的嗜酸乳杆菌GAPDH,为进一步研究其免疫功能以及开发为免疫促进剂打下了基础.
关键词： 3-磷酸甘油醛脱氢酶 嗜酸乳杆菌 纯化 N端测序 二聚体 -
应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和N端测序鉴定重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构
目的:应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和N端测序方法鉴定重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构.方法:1.用Edman降解法进行N端测序.2.应用MALDI-TOF-MS测定分子量并鉴定纯度.3.通过还原、烷基化确定rhGM-CSF分子中二硫键数目.4.通过蛋白内切酶Glu-C酶切的肽质量指纹谱确证氨基酸序列并确证其中两对二硫键的配对.结果:1.测定的rhGM CSF N端15个氨基酸序列与从cDNA推导的序列一致.2.测定的rhGM-CSF分子量与理论计算值一致.3.证明rhGM-CSF没有自由巯基,含有两对二硫键,与理论值一致.4.证明rhGM-CSF的氨基酸序列是正确的,并确证其中的两对二硫键配对正确.结论:确证重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的结构是正确的,没有修饰、变异和氨基酸的丢失.应用的方法灵敏、准确、可靠.
