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氢化可的松联合rmIL-2、rmIL-15体外扩增小鼠NK细胞
目的 建立氢化可的松联合rmIL-2、rmIL-15体外扩增小鼠NK细胞的方法,观察该培养方法对扩增后NK细胞的纯度、扩增效率及功能的影响.方法 应用免疫磁珠分选法(MACS)分离得到高纯度的小鼠脾脏CD3-CD49b+ NK细胞,依据添加刺激因子的不同将纯化后的NK细胞分成A组(rmIL-2)、B组(rmIL-2+rmIL-15)和C组(氢化可的松+rmIL-2+rmIL-15)进行体外培养,每3日添加新鲜培养基及细胞刺激因子.采用台盼蓝拒染法进行活细胞计数;流式细胞术检测CD3-CD49b+NK细胞纯度;CFSE稀释法检测NK细胞的增殖效率;MTT比色法检测NK细胞杀伤活性;流式细胞术检测NK细胞膜表面CD107a的表达.结果 磁珠分选后NK细胞纯度由分选前的(8.59±1.41)％提高为分选后的(91.60±1.33)％.体外扩增培养15 d后A组扩增的NK细胞纯度降低[(75.02±3.48)％,P＜0.01],B组(85.87±4.79)％和C组(88.04±3.35)％与扩增前相比较无明显差异(P＞0.05).扩增15d后C组NK细胞扩增倍数为(45.06±1.64)倍,显著高于A组(5.28±0.34,P＜0.01)和B组(25.39±3.29,P＜0.05).细胞增殖实验结果表明培养第7天和第14天各组NK细胞增殖指数(PI)分别为A组(2.26±0.81)和(3.27±1.21),B组(4.62±1.45)和(15.82±3.92),C组(6.91±1.34)和(23.66±5.42).培养第7天和第14天NK细胞增殖指数C组＞B组＞A组(P＜0.05).当效靶比为10∶1时,C组扩增后NK细胞肿瘤杀伤率为(81.27±2.32)％,显著高于A组[(37.20±7.32)％,P＜0.01]和B组[(69.51±6.32)％,P＜0.05]扩增后NK细胞.C组(49.32±4.36)％扩增后NK细胞CD107a表达水平显著高于A组[(9.37±1.82)％,P＜0.001]和B组[(28.46±4.21)％,P＜0.01)]NK细胞.结论 氢化可的松联合rmIL-2+rmIL-15培养方案能够有效地体外扩增并活化小鼠NK细胞,为NK细胞的肿瘤过继免疫治疗应用于临床奠定了实验基础.
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一种分离、培养扩增小鼠NK细胞方法的建立
目的:建立小鼠NK细胞的分离及培养扩增的方法.方法:用两步黏附分离法和磁珠活化的细胞分选(MACS)法,从小鼠脾脏的单个核细胞(MNC)中分离NK细胞,计数所得细胞的总数,并用FITC-抗小鼠CD3和PE-抗小鼠NK1.1单克隆荧光抗体染色后,用流式细胞仪(FACS)检测NK细胞的纯度.以YAC-1细胞为靶细胞,用MTT比色法检测NK细胞的杀伤活性.结果:将两步黏附分离法分离的2×107个脾MNC培养5、10、15、20d,计数细胞的总数并检测CD3-NK1.1+细胞百分率,分别为0.5×107、1.4×107、2.6×107、3.0×107和18.36%、43.44%、55.68%、60.03%.效靶细胞25:1时,NK细胞的杀伤率分别为54.38%、66.54%、79.38%和83.86%,明显高于脾MNC(41.93%)(P＜0.01).MACS法纯化前后细胞的总数和CD3-NK1.1+细胞的百分率,分别为1.0×108、1.5×106和2.54%、93.60%;但纯化后的细胞在体外培养20d时,只扩增到1.9×106个.结论:用两步黏附分离法分离的小鼠NK细胞,培养2～3wk可获得大量的NK细胞,纯度可达55%～60%;在效靶细胞为25:1时,NK细胞对YAC-1细胞的杀伤率约为80%.
