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杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白N端胞外区基因(ast1)的克隆及表达
构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白N端胞外区基因(ast1)的原核表达重组质粒pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21中进行表达.从杜氏利什曼原虫基因组DNA中扩增无鞭毛体蛋白基因并用SOSUI 和Tmpred方法预测其跨膜区结构;根据跨膜区预测的结果,扩增基因ast1并将其连接到原核表达载体pET32a(+)中,重组质粒命名为pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌 BL21(DE3)中进行表达.SDS-PAGE 和免疫印迹分析表明,在约27 kDa处获得重组目的蛋白rAST1的表达,显示成功构建杜氏利什曼原虫原核表达重组质粒pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21中获得有效表达.
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杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建
目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin.方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin.结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确.结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin.
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杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达
目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin, 并研究其在NIH3T3细胞中的表达.方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增.将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3.1(+)中, 构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin.以pcDNA3.1-amastin转染NIH3T3细胞, 采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3.1-amastin的瞬时表达和稳定表达.结果:在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光, 表明pcDNA3.1-amastin成功地转入NIH3T3细胞, 并在细胞膜和细胞内获得短暂表达.稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后, 用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因, 表明获得了稳定表达.结论:成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒, 并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达.
