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基于RASSF1A为标志的无损性孕妇血浆中胎儿RHD-DNA检测方法的建立
目的 建立基于表观遗传标志RASSF1A为标志的孕妇外周血浆中胎儿RHD-DNA检测路径,用于无损性产前胎儿RhD血型预测.方法 首先采用PCR-SSP对孕妇外周血细胞基因组DNA做RHD基因多个外显子检测,以确定其RHD基因型;其次对无外显子表达或部分外显子表达的孕妇,对其外周血浆中胎儿游离的DNA采用RT-PCR扩增其RHD基因exon7与10,同时扩增SRY基因;另对exon 7、10和SRY都为阴性的标本检测甲基化RASSF1A基因作为胎儿DNA存在的标志.待胎儿分娩后,将基因检测结果与婴儿血清学检测结果比对,以评价该方法的准确性.结果 57位受检孕妇中,含RHD全部外显子者有17人;3人含exon1和10,为RHD1-CE(2-9)-D10杂化基因;37人不含外显子.后两者40名孕妇中,22人检测出SRY基因,出生胎儿均为男性;另有2人为假阴性结果.39人检测出exon 7和10,其中38人基因型结果与胎儿出生后血清学结果相符,1例假阳性结果;1人未检测到SRY、exon 7和10的标本,检测到RASSF1A证明胎儿DNA存在,且胎儿出生后证实为RhD阴性女婴.结论 建立了基于RASSFIA为标志的、符合中国人RHD基因特点的RhD阴性孕妇血浆游离DNA中胎儿RHD基因的检测程序,可用于临床无损性产前胎儿RhD血型预测.
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应用巢式PCR检测孕妇血浆中cffDNA RHD基因型的研究
目的 建立巢式PCR技术检测RhD阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA(cffDNA)的RHD基因型,以预测胎儿RhD血型.方法 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取32例RhD阴性孕妇血浆游离DNA,针对RHD外显子7和10分别设计外侧、内侧2组特异性引物,巢式PCR方法检测孕妇血浆游离胎儿DNA的RHD型,测序验证PCR产物的序列特异性.结果 孕妇血浆游离DNA经巢式PCR扩增后,有27例成功扩增出RHD外显子7、10特异性条带,5例未检测到RHD基因特异性扩增,32例中有30例胎儿RHD型与出生后血型相符,检测准确率为93.1％.结论 采用巢式PCR技术检测RhD阴性孕妇血浆游离胎儿DNA来判定胎儿RHD型,具有良好的准确性、敏感性和特异性,为RhD新生儿溶血病的早期诊断提供了一种新的、可靠的检测手段.
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利用RASSF1A位点检测母体血浆中胎儿SNP分型
目的 探讨利用母体血浆中高甲基化RASSF1A位点进行胎儿SNP分型的应用价值.方法 随机收集10个未孕健康妇女和45例不同孕期(早期5例、中期20例、晚期20例)孕妇的血样本及相应胎儿组织(绒毛组织、羊水、胎盘组织);利用甲基化敏感限制性内切酶BstUI酶切后进行PCR,产物进行血细胞、血浆和胎儿组织(绒毛或胎盘)DNARASSF1A序列的甲基化模式检测,并采用直接测序法对SNP rs4688725位点进行分型.结果 经BstUI酶消化,RASSF1A序列在母体血细胞中均未检出,而在绒毛或胎盘组织中均能检出;在45名孕妇血浆中,RASSF1A序列均能被检出,且序列内的SNP分型与相应胎儿组织一致;在10名非孕妇女血浆中均未检出RASSF1A序列.结论 母体和胎儿DNA中RASSF1A基因启动子区域的甲基化模式存在差异,可用于对母体血浆中的游离胎儿DNA进行SNP分型.
