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PCR技术在母婴ABO血型不合早期诊断中的临床应用探讨
目的 建立一种利用孕妇血浆中游离DNA直接检测胎儿ABO血型,用于母婴ABO血型不合的无创性产前诊断方法.方法 首先检测孕妇血浆中的抗A (B) IgG抗体,然后利用硅胶膜柱提取的方法从60例13～37 w(IgG≥1∶64)可疑母婴ABO血型不合的孕妇血浆中提取胎儿DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测胎儿ABO血型,后取婴儿脐血进行血清学证实.结果 60例标本中,检出51例,检出率85.0％,出生后血清学证实47例诊断正确,诊断正确率92.16％.结论 PCR技术利用孕妇血浆中游离DNA检测胎儿ABO血型可行,结果可靠,对诊断和预防母婴ABO血型不合所致溶血病的发生具有重要意义.
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孕妇血浆游离DNA的定量分析
目的 探讨孕妇血浆游离DNA在唐氏筛查和非创伤性产前诊断中的价值.方法 从正常女性、孕中期孕妇、唐氏高危孕妇和孕晚期孕妇的血浆中分离游离DNA,并采用实时定量荧光PCR检测3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)及男性特有Y性别决定区基因(sex determining region Y, SRY).结果 未孕妇女、孕中期、唐氏高危、孕晚期孕妇GAPDH拷贝数均值分别为(6.40×103±1.94×103) copy/mL、(4.28×103±1.36×103) copy/mL、(3.08×104±1.67×104) copy/mL和(4.33×104±2.32×104) copy/mL;孕中期、唐氏高危、孕晚期孕妇SRY拷贝数均值分别为(174.02±98.56) copy/mL、(1065.01±588.72) copy/mL、(2627.58±1257.94) copy/mL.孕晚期和唐氏高危孕妇血浆游离DNA含量较孕中期孕妇增加(P＜0.001或P＜0.005).结论 孕妇血浆游离DNA的定量分析在唐氏筛查和无创伤性产前性别诊断中有重要的应用价值.
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血浆游离DNA的STR分型检测研究
目的：探讨利用血浆中游离DNA进行短串联重复序列（short tandem repeat，STR）分型检测，解决法医学个体识别和亲权鉴定问题的可行性。方法采集36例无关健康个体EDTA-Na2抗凝血样，分离血浆，采用经典酚-氯仿法分别处理血浆和血细胞，对提取的DNA进行15个STR基因座常规PCR扩增和荧光标记复合扩增，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳检测2种STR分型方法进行检测。结果常规PCR扩增银染检测和荧光标记复合扩增毛细管电泳检测两种STR分型方法的结果表明，同一个体的血浆游离DNA和血细胞DNA STR分型一致，且分型效果接近。结论血浆游离DNA可作为一种有效的生物学样本进行STR分型检测，应用于法医个体识别和亲权鉴定。
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中国健康人血清游离表皮生长因子受体外显子18～22序列分析
目的 分析中国健康人血清游离DNA中表皮生长因子受体(EGFR)外显子18～22基因序列是否存在突变,为监测EGFR酪氨酸激酶选择性抑制荆(EGFR TKIs)的临床疗效提供正常参考数据.方法 采用高灵敏度DNA提取方法结合高保真巢式PCR和基因测序技术对42例中国健康人外周血血清游离DNA中EGFR TKIs作用靶点所在结构域即EGFR外显子18～22的基因序列和氨基酸序列进行分析.结果 从外周血血清游离DNA中均扩增出EGFR外显予18～22的基因片段,片段大小(分别为400,374,404,408争419 bp)与预期设计片段完全相符.健康人外周血游离DNA中存在EGFR基因突变,突变频率出现多的是EGFR外显子20.41名健康人样本中有7例样本出现1处相同位点的沉默点突变(4838499 G→A),其氨基酸序列(Glu)没有发生改变;EGFR外显子18也出现点突变,34名健康人样本中有1名健康者样本出现3处点突变,其中2处点突变(4830989 G→C;4831025 G→C)导致氨基酸序列发生改变(Glu→Gln;Ala-Pro),另外1处点突变(4831000 A→C)为沉默突变,其氨基酸序列(Thr)没有发生变化;EGFR外显子19、外显子21～22没有出现基因突变.结论 通过巢式PCR结合基因测序可以分析外周血游离DNA中EGFR基因序列,健康人外周血游离EGFR外显子18和20存在基因点突变,其中外显子18的点突变导致了氨基酸序列改变.
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血浆DNA含量及完整性在早期胃癌诊断中的价值
目的:探讨血浆DNA含量及完整性指数在早期胃癌诊断中的临床应用价值.方法:收集28例Ⅰ/Ⅱ期胃癌术前患者、18例胃良性疾病和28例正常个体外周血标本.通过扩增重复短片段ALU115和长片段ALU247,检测血浆游离DNA含量及完整性指数.结果:血浆ALU115片段含量在早期胃癌组较良性组和正常组明显升高(P =0.0017).但是完整性指数在三组之间未见到统计学差异.结论:联合检查ALU115和传统肿瘤标记物可以有效筛查早期胃癌.血浆DNA的含量在早期胃癌的筛查中有临床应用价值.
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磁珠直接吸附法对体态检材游离DNA的提取
目的 采用磁珠直接吸附法对人体尿液、唾液、血液3种体态生物检材中的游离DNA进行提取检验,为法医物证中游离DNA的研究及检验工作提供参考.方法 对3种生物检材采取离心吸取上清液的方法分离游离DNA,然后采用磁珠直接吸附法进行提取纯化,Identifiler-Plus试剂盒进行复合扩增后常规STR检测.结果 在3种检材中均检出了游离DNA,其中血液中游离DNA检出率为100%,唾液为90%,尿液为70%.结论 人体体态生物检材中存在游离DNA,同时磁珠直接吸附法可高效、快捷的提取生物检材中的游离DNA.
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微量接触类生物检材的游离DNA问题分析
目的 探究接触类生物检材的游离DNA问题,游离DNA和细胞内DNA含量的比例问题,以及游离DNA在法医检验中的影响.方法 对手部、面部和足部的皮肤及口腔粘膜进行模拟微量接触类检材的制备,对模拟检材进行浸泡,对游离DNA进行定量和STR扩增,对剩余检材使用常规程序进行DNA提取、定量和STR扩增,并对结果进行分析和讨论.结果 实验观察到,78.55％的样品检测到了游离DNA,其中,手部模拟检材的游离DNA检测率为82.1％,脸部模拟检材的游离DNA检测率为82.1％,口腔模拟检材的游离DNA检测率为96.4％,足部模拟检材的游离DNA检测率为53.6％,微量接触类检材中游离DNA量占DNA总量的12.9％.结论 接触类生物检材中提取到的DNA,除了包括细胞内DNA,还存在一定比例的细胞外游离DNA,这为微量接触类检材的DNA有效提取和检验提供了新的理论依据.
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非小细胞癌患者外周血游离DNA与检测EGFR基因突变的相关研究分析
目的 探究非小细胞癌患者外周血游离DNA与检测EGFR基因突变的相关性.方法 本研究选择在我院进行收治的非小细胞肺癌患者70例,提取外周游离DNA和肿瘤组织比较突变率及两者的一致性.结果 45例EGFR突变标本中,腺癌32例(71 11％),鳞癌13例(28 89％),肺腺癌的发生率明显高于肺鳞癌;男性16例,女性29例,女性的突变率显著高于男性,具有统计学意义(P＜0 05);肿瘤组织EGFR突变共有45例,其中外周血同样有EGFR突变的有41例,两者差别不大,一致性为0.911,两者高度一致.结论 针对于非小细胞癌患者进行检测,采集其外周血游离DNA方便、快捷,可作为首选方法,而且检测EGFR基因突变,采集患者外周血游离DNA在一定程度可以代替肿瘤组织的检测.
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血浆游离DNA完整性检测对炎症性肠病患者结直肠癌变筛查的价值
目的 评估外周血游离DNA(cfDNA)的完整性(cfDI)检测对炎症性肠病(IBD)患者结直肠癌变筛查的价值.方法 采用实时定量PCR法检测78例克罗恩病(CD)、67例溃疡性结肠炎(UC)、40例结直肠癌(CRC)患者及37例健康志愿者的血浆Alu115cfDNA和AIu247cfDNA含量,计算cfDI(Alu247/Alu 115 cfDNA比值).比较活动期CD(ACD)、缓解期CD(RCD)、活动期UC(AUC)、缓解期UC(RUC)、CRC患者和健康志愿者的外周血cfDNA含量和cfDI.采用ROC曲线分析血浆cfDI对结直肠癌的诊断效能.结果 CRC组的cfDI为0.317 (0.246,0.370),显著高于健康对照组的0.265(0.203,0.334) (P=0.017)、ACD组的0.260(0.251,0.277) (P=0.005)、AUC组的0.267(0.191,0.316)(P=0.017)、RCD组的0.254(0.235,0.278) (P=0.005)和RUC组的0.278(0.236,0.309)(P=0.041),差异均有统计学意义,而其他各组间cfDI差异均无统计学意义.ROC曲线分析显示,cfDI在其相应临界值时,CRC组区分健康对照组、ACD组、RCD组、AUC组、RUC组的ROC曲线下面积分别为0.643、0.692、0.674、0.650和0.665,P值分别为0.031、0.003、0.010、0.025和0.017.结论 外周血cfDI有助于IBD与CRC的鉴别诊断,可能成为IBD患者结直肠癌变监测的潜在生物学指标.
