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脑脊液ctDNA检测结果指导治疗肺癌脑转移1例
患者男性,61岁.因咳嗽1个月于2015年6月收入北京医院,既往无吸烟史.基线CT检查提示左肺上叶占位,双肺多发转移病灶,头腹CT及骨扫描未发现转移.2015年7月行纵隔7区淋巴结经纤维支气管镜针吸活检术,组织病理提示腺癌,ARMS法检测EGFR无突变,Ventana IHC ALK(-).
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以浆膜腔积液上清为标本检测ras基因第12密码子突变及其意义
有研究显示,体液中的游离核酸可直接用于肿瘤的分子诊断,且效果优于以体液中的脱落细胞为实验材料[1].近年来随着肿瘤发病率的上升,恶性浆膜腔积液的比例不断升高,但部分恶性积液的诊断一直困扰人们.ras基因第12密码子突变广泛存在于多种恶性肿瘤,是研究肿瘤基因诊断较为理想的"通用"靶基因之一.本研究以浆膜腔积液上清为标本对K-ras和H-ras基因第12密码子突变进行聚合酶链反应扩增及限制性片段长度多态性(PCRRFLP)分析,探讨它们对恶性积液的诊断价值.
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乳腺癌患者血清游离DNA与相关miRNA的表达水平
目的 通过检测乳腺癌患者血清游离DNA和miRNA表达情况,探讨新的乳腺癌血液肿瘤标志物及其与乳腺癌的关系.方法 选取2013年12月-2015年12月上海市长宁区妇幼保健院36例乳腺癌患者及31例正常健康者,采用实时定量PCR技术检测其血清游离DNA中GAPDH基因拷贝数,分析其游离DNA表达水平,利用荧光逆转录PCR技术检测其血清中miRNA-155、miRNA-1304、miRNA-181a、miRNA-182、miRNA-423含量,结果进行2(-△CT)处理得出miRNA相对表达水平,并分析上述指标与临床病理资料的关系.结果 乳腺癌患者血清中游离DNA和miRNA-155水平明显高于正常健康者,差异有统计学意义(P＜0.05),两组间miRNA-1304、miRNA-181a、miRNA-182、miRNA-423表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).血清游离DNA和miRNA-155水平与肿瘤的病理类型、肿瘤大小和ER表达情况无关(P＞0.05).结论 游离DNA和miRNA在乳腺癌患者血清中差异表达,且其表达水平不受肿瘤的病理类型、肿瘤大小和ER表达情况的影响,此类遗传物质有望成为乳腺癌新的血清肿瘤标志物.
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孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA在无创性唐氏综合征检测中的应用
目的:探讨利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA进行无创性唐氏综合征检测的可行性及其应用前景.方法:选取2013年6月～2014年1月在陕西地区参加产前检测的单胎妊娠孕妇809例.采集参检孕妇10ml外周血,提取血浆游离DNA,构建测序文库,在HiSeq 2500平台上进行高通量测序,测序结果与人类标准参考基因组进行比对分析并判断胎儿患唐氏综合征的风险;检测结果为高风险的孕妇,后期采集胎儿羊水,经细胞培养后进行染色体核型分析验证.结果:809例样本经过DNA测序和数据统计分析,检测出9例21-三体综合征和1例18-三体综合征,其余检测结果未见异常;其中8例测序分析结果为高风险的孕妇经后期核型分析验证,与羊穿结果符合率100％.结论:孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA,可用于唐氏综合征的无创性产前筛查,该方法具有特异性强、假阳性率低和无并发症发生率低等优势.
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母血游离DNA、甲胎蛋白和人绒毛膜促性腺激素联合检测在21-三体综合征产前筛查中的应用
目的 探讨孕期母血游离DNA(fDNA)、甲胎蛋白(AFP)和人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)与21-三体综合征检出的关系.方法 对3 698例妊娠15 ～ 20+6周的妇女采用化学发光免疫分析法测定孕妇血清中AFP和β-hCG水平,并对高危孕妇采用实时定量PCR技术复诊检测孕妇血浆游离fDNA含量,通过染色体检查和随访进行终确诊.结果 筛查出高风险孕妇例192例,占5.19％.经染色体分析确诊21-三体综合征患儿5例,出生后随访和染色体分析确诊21-三体综合征患儿1例,产前诊断阳性检出率为83.33％.结论 孕期母血fDNA、AFP及β-hCG是产前筛查21-三体综合征的有效指标,可以提高产前诊断效率,获得较令人满意的筛查结果.
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卵巢恶性肿瘤患者血浆游离DNA含量测定及临床意义
目的:检测卵巢恶性肿瘤患者血浆游离DNA的含量并探讨其临床应用价值.方法:采集30例卵巢恶性肿瘤、20例卵巢良性肿瘤患者及20例健康妇女的外周血,以及卵巢恶性肿瘤患者术后1周和1个月的外周血,采用微量基因组提取试剂盒提取血浆DNA,双链DNA高敏试剂盒和荧光仪测定血浆DNA含量.结果:卵巢恶性肿瘤患者血浆DNA含量[(25.33±17.69)μg·L-1]明显高于正常者[(7.60±3.87)μg·L-1]和良性肿瘤患者[(10.28±4.80)μg·L-1](P<0.001),良性肿瘤患者的血浆DNA水平与正常者之间比较差异无显著性(P>0.05).恶性卵巢瘤Ⅰ～Ⅱ期患者的血浆DNA含量[(15.83±5.30)μg·L-1]明显高于正常对照组(P<0.01),Ⅲ～Ⅳ期患者的血浆DNA含量[(30.83±20.04)μg·L-1]高于Ⅰ～Ⅱ期(P=0.005);有腹膜后淋巴结转移或远处转移者的血浆DNA含量[(35.43±21.08)μg·L-1]较无转移者[(16.49±6.44)μg·L-1]明显升高(P=0.006);手术后1周,卵巢恶性肿瘤患者的血浆DNA含量[(20.88±12.14)μg·L-1]与手术前比较无明显差别(P>0.05),手术后1个月,卵巢恶性肿瘤患者的血浆DNA含量[(10.30±2.45)μg·L-1]较手术前明显下降(P<0.001),基本恢复到正常水平;高血浆DNA含量组的累积生存率明显低于低血浆DNA含量组(P=0.027).以正常对照者血浆DNA水平的95%可信区间上限15.70μg·L-1为临界值,其诊断的敏感性为63.30%,特异性为90.00%.结论:血浆DNA水平有可能成为辅助早期诊断卵巢恶性肿瘤、判断肿瘤侵袭转移情况和预测预后的指标之一.
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血浆游离 DNA 作为急性冠状动脉综合征诊断生物标志物的价值
目的：以Alu为靶基因，探讨血浆游离DNA（cfDNA）作为急性冠状动脉综合征（ACS）诊断生物标志物的价值。方法采用基于Alu基因的支链DNA（bDNA）技术定量检测140例ACS患者（ACS组）和60名健康体检者（正常对照组）血浆cfDNA水平，并对部分行经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术的ACS患者进行术前和术后的动态观测。采用化学发光法检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌红蛋白（MYO）水平，分析cfDNA与cTnI、CK-MB、MYO的相关性，采用受试者工作特征（ROC）曲线评价cfDNA诊断ACS的价值。结果ACS组血浆cfDNA水平为2550.3（969.9～4866.4）ng/mL，明显高于正常对照组[118.3（81.1～221.1）ng/mL，P<0.001]。10例行PCI术的ACS患者术前、术后血浆cfDNA水平差异无统计学意义（P>0.05），但术后呈下降趋势。cfDNA与cTnI、CK-MB、MYO水平无相关性（r2=0.031、0.152、0.217， P>0.05）。ROC曲线分析显示cfDNA诊断ACS的ROC曲线下面积（0.95）和敏感性（82.76%）优于cTnI （0.57和22.41%）、CK-MB（0.81和20.69%）及MYO（0.64和10.34%），4项指标的特异性均为100.00%。结论 ACS患者cfDNA水平明显升高，其临床诊断效能明显高于目前临床常用的心肌标志物，可作为诊断ACS重要的生物学指标。
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血浆游离DNA定量检测对炎症性肠病活动性评估的价值
目的 探讨血浆游离DNA对IBD活动度评估的价值.方法 选取2014年7月至2017年6月福建医科大学附属第一医院收治的145例IBD患者,采用PicoGreen荧光比色法定量检测患者的血浆游离DNA含量,以同期37名体格检查者为健康对照组,分析IBD患者的游离DNA含量与CRP、ESR和IBD活动度的相关性.以ROC曲线评估游离DNA含量对IBD活动度的诊断效能,组间比较采用两独立样本t检验,Pearson相关系数分析两变量的相关性.结果 CD和UC患者的游离DNA含量分别为(29.17±2.07)μg/L和(26.86±1.97)μg/L,均高于健康对照组的(21.10±1.02)μg/L,差异均有统计学意义(t=2.609、2.082,P均<0.05).活动期CD、UC患者的血浆游离DNA含量分别为(35.72±3.26)、(32.37±3.42)μg/L,均分别高于缓解期CD、UC患者的(21.12±1.43)、(20.82±1.02)μg/L,差异均有统计学意义(t=3.806、3.116,P均<0.01).CD患者游离DNA与CRP、ESR、疾病活动度均呈正相关(r=0.555、0.393、0.400,P均<0.01),UC患者游离DNA与CRP、ESR、疾病活动度均呈正相关(r=0.640、0.421、0.360,P均<0.01).CRP联合ESR诊断CD的效能高,AUC值为0.841,灵敏度和特异度分别为81.4％ 和74.3％;游离DNA、CRP、ESR联合诊断UC的效能高,AUC值为0.851,灵敏度和特异度分别为74.3％ 和96.9％.结论 IBD患者游离DNA含量升高与IBD炎性活动有一定关联,检测游离DNA有助于识别活动期IBD,联合ESR和CRP检测可提高对UC的识别效率.
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乳腺癌患者血清游离DNA的定量检测
目的:定量检测乳腺癌患者血清中的游离DNA,并评估其应用前景.方法:采用荧光定量PCR方法检测100例健康女性志愿者、100例乳腺良性疾病患者和200例乳腺癌患者血清游离DNA中GAPDH基因拷贝数,以此作为评估DNA含量的指标.结果:以≥1×103基因拷贝数作为阳性标准,93％健康女性和95％乳腺良性疾病患者DNA检测为阴性,而84.5％乳腺癌患者DNA检测为阳性,其中Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者阳性率为84％.DNA含量在3组之间的差异有统计学意义(P＜0.005).结论:早期乳腺癌患者血清中存在一定数量肿瘤源性的游离DNA,此类遗传物质可以作为一类特异性的生物学标志物.
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血清循环DNA的EGFR基因突变与肺癌选择性靶向治疗研究
目的:通过血清循环DNA的基因突变检测,筛选EGFR突变型肺癌患者并评估靶向性药物吉非替尼对其的临床疗效.方法:从肺癌患者血清中提取DNA,采用PCR扩增和基因测序检测EGFR突变.结果:116例肺癌血样中检出EGFR突变46例,突变率为39.7 %,其中外显子19和21 突变分别占65.2 % (30/46例)和 34.8 % (16/46例),EGFR基因突变多见于女性患者和肺腺癌(包括腺鳞癌)患者.对20例肺癌的进一步分析证明,血清EGFR基因突变类型与患者自身肿瘤的突变类型相同.另外通过血清循环DNA基因检测法筛选了19例化疗失败的突变型晚期肺癌进行吉非替尼靶向治疗,客观有效率为52.6%,病情控制率为89.5%,中位无进展生存时间为8个月,中位生存时间为12个月,2年生存率达到33.3%.结论:证实血清循环DNA与肿瘤组织DNA的EGFR基因突变一致;以血清循环EGFR突变检测结果为依据选择分子靶向性药物吉非替尼治疗,对晚期肺癌患者疗效明显.
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晚期肺癌血清游离DNA中EGFR外显子19的基因突变研究
目的:分析晚期肺癌的上皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)外显子19基因突变的类型及发生率.方法:从血清中提取游离DNA进行EGFR外显子19特异性PCR扩增和基因测序.结果:24例肺部良性疾病血样中EGFR基因外显子19均为野生型;而130例肺癌血样中检出突变55例,EGFR外显子19基因突变的检出率为42.3%.外显子19基因突变均为第746～752位密码子的碱基缺失,共有7种突变类型.外显子19基因突变主要见于肺腺癌及小细胞肺癌,其检出率分别为58.9%和57.1%,突变与患者年龄及性别无明显相关性.在肺癌的不同组织类型中,外显子19的突变形式存在显著差异,肺腺癌的基因突变谱与肺鳞癌、腺鳞癌及小细胞肺癌明显不同.结论:晚期肺癌病人的血清游离DNA中存在EGFR基因突变,这类突变可以通过适当的方法检测出来,这种血液检测方法在晚期肺癌的EGFR基因诊断及靶向治疗中具有广泛的应用价值.
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NSCLC患者血浆游离DNA检测的临床意义
目的 评估血浆游离DNA含量在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)诊疗中的应用价值.方法 收集61例非小细胞肺癌患者和18例健康人的血浆,提取血浆游离DNA,荧光定量PCR方法检测DNA浓度.结果 健康人血浆游离DNA水平中位数为73.70(53.49～85.03) ng/ml,非小细胞肺癌患者血浆游离DNA水平为179.43(160.94 ～ 401.34) ng/ml,两者间差异有统计学意义(P＜0.01).血浆游离DNA含量与非小细胞肺癌患者的性别、年龄、吸烟状况及病理类型均无明显相关性,与有无转移存在相关性(P＜0.01).结论 非小细胞肺癌患者的血浆游离DNA是一种潜在有价值的生物学标志物,可作为临床上诊断肺癌、预测疾病进展、快速评估治疗疗效的工具.
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改良Blocker PCR检测EGFR-TKI耐药后非小细胞肺癌血浆EGFR T790M突变的价值
目的 探讨改良PCR(Blocker PCR)方法在晚期非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者血浆游离DNA(cell free DNA,cfDNA)中检测继发EGFR T790M突变的应用价值.方法 采用Blocker PCR方法对127例表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)耐药后肺癌患者的血浆标本行EGFR敏感突变和T790M突变检测,统计T790M突变的检出率;为验证Blocker PCR血浆检测的可靠性,部分患者血浆标本行二代测序(next generation sequencing,NGS)和Blocker PCR配对比较;获得配对血浆和组织的病例行Blocker PCR配对检测.结果 在127例采用BlockerPCR方法检测的EGFR-TKI耐药NSCLC患者中,T790M耐药突变的检出率为40.15％ (51/127),其中21.56％ (11/51)为单纯T790M耐药突变,78.44％ (40/51)为T790M合并原有EGFR敏感突变.组织与血浆配对检测中,EGFR-TKI耐药后二次活检组织标本T790M的检出率为54.54％(6/11),血浆T790M的检出率为43.75％ (14/32).在同时行Blocker PCR和二代测序基因检测的18例患者中,敏感突变位点及T790M突变位点在两种检测方法中的一致率均为100％.结论 在EGFR-TKI耐药后的NSCLC患者中使用Blocker PCR检测血浆T790M突变是对组织活检的重要补充.
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肝胆胰恶性肿瘤患者游离DNA的含量及完整性的研究
目的 探讨肝胆胰恶性肿瘤患者游离DNA的含量及完整性在临床诊断上的价值.方法 收集肝胆胰恶性肿瘤患者血标本共43例(其中原发性肝细胞肝癌15例,胆道系统恶性肿瘤14例,胰腺癌14例),同期正常人血标本40例.检测短片段(ALU115)及长片段(ALU247)游离DNA的含量,并计算游离DNA的完整性(长片段含量/短片段含量).结果 恶性肿瘤患者游离DNA的ALU115、ALU247含量中位数分别为2.89 ng/μL及1.19ng/μL,显著高于正常组0.85ng/μL及0.28 ng/mL(P＜0.001).游离DNA的含量及完整性与肿瘤大小及分期、神经、脉管受侵无明显关联.ALU247 ROC曲线下面积为0.85,比短片段的0.80及完整性的0.56都高.结论 游离DNA含量在肝胆胰恶性肿瘤患者与正常人有明显区别,且ALU247敏感性及特异性更高,可考虑作为肿瘤诊断的新指标.
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血浆游离DNA在老年骨折患者深静脉血栓形成中的辅助诊断价值
目的 探讨血浆游离DNA(cfDNA)水平对老年骨折患者深静脉血栓形成(DVT)的辅助诊断价值.方法 根据加压双向超声将106例股骨骨折患者分为骨折DVT组50例和骨折非DVT组56例.用荧光染料法定量测定血浆cfDNA浓度,同时检测患者外周血WBC、PLT、C反应蛋白(CRP)、D-二聚体(DD)水平.结果 骨折DVT组血浆cfDNA水平为337.38(272.89,436.42) ng/mL,高于骨折非DVT组232.56 (208.54,280.89) ng/mL,P＜0.01;PLT、DD均高于骨折非DVT组(P均＜0.01),而WBC、CRP低于骨折非DVT组(P均＜0.01.血浆cfDNA与PLT、DD均呈正相关,与WBC呈负相关,相关系数(r)分别为0.273、0.365、-0.255,P均＜0.01.cfDNA、DD诊断DVT的ROC曲线下面积分别为0.825、0.733,临界值分别为287.86ng/mL和3.4 mg/L FEU(fibrinogen equivalent units)时,敏感性分别为72％、96％,特异性分别为85.5％、43.6％.结论 DVT患者cfDNA水平升高,其临床诊断效能优于DD,可作为辅助诊断DVT的生物学指标之一.
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游离DNA对卵巢癌辅助诊断价值的研究
目的 用分支DNA(bDNA)技术定量检测卵巢癌患者血清游离DNA (cf-DNA)含量,探讨其与临床病理参数的关系及对卵巢癌辅助诊断的价值.方法 收集67例卵巢癌患者、22例卵巢良性肿瘤患者和29例健康妇女静脉血标本.用bDNA技术检测各组血清cf-DNA浓度,化学发光法检测血清CA125和HE-4含量;用Krudkal-Wallis H检验比较各组间总体差异,MannWhitney U检验进行两两比较;绘制ROC曲线评价上述三项指标的诊断效能.结果 卵巢癌组、卵巢良性肿瘤组和健康对照组血清cf-DNA含量分别为:865.41(497.62 ～1 311.56)、221.08 (90.93～356.07)和199.94(78.73～396.21) μ,g/L,卵巢癌组显著高于良性肿瘤组和健康对照组(P均＜0.01);按FIGO分期为Ⅲ期和Ⅳ期的卵巢癌患者显著高于Ⅰ～Ⅱ期组(P均＜0.01),Ⅲ期和Ⅳ期组间差异也有统计学意义(P＜0.05).卵巢癌组血清cf-DNA的ROC曲线下面积、诊断敏感性和特异性分别为:0.886、83.9％、84.2％,均高于CA125 (0.774、74.2％、63.2％)和HE-4(0.706、74.2％、78.9％),cf-DNA、CA125和HE-4联合检测的敏感性和特异性可提高到92.54％ (62/67)、88.24％ (45/54).结论 bDNA技术检测血清cf-DNA对卵巢癌诊断的敏感性和特异性高于CA125和HE-4,可作为卵巢癌辅助诊断的一个重要分子生物学指标.
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游离DNA检测对结直肠癌诊断价值的研究
目的 探讨游离DNA(cell-free DNA,CFD)检测在结直肠癌(CRC)诊断中的价值.方法 用分支DNA技术检测CRC、结肠息肉患者和健康人对照组血清中的CFD含量,同时检测血清CEA和CA19-9含量,结合临床资料进行统计分析.结果 与健康人对照组血清CFD水平[M(P25,P75)]的[181.9(109.5,328.7) ng/mL]和结肠息肉组的[178.2(85.5,377.5) ng/mL]相比,CRC患者为1245.4 (578.2,1798.3) ng/mL,差异有统计学意义(U=416.00,282.00,P＜0.05)；CRC患者血清CEA和CA19-9水平显著高于结肠息肉组和健康人对照组(P均＜0.05)；不同年龄、性别、肿瘤部位和TNM分期的CRC患者CFD水平无统计学差异(P ＞0.05)；CRC患者血清CFD水平与CEA(r=0.190,P＞0.05)和CA19-9(r=0.046,P＞0.05)均无相关性；CRC患者血清CFD的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.926,cut off值为768.9 ng/mL时,诊断CRC敏感性为70.5％,特异性为98.9％.结论 血清CFD可作为CRC辅助诊断的分子标志物.
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循环游离核酸的检测及意义
游离核酸与肿瘤、妊娠相关性疾病、自身免疫病、移植排斥反应、创伤、急救医学等有着密切关系,其检测对疾病的早期诊断、分期、监测、预后判断等有重要意义.
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精浆游离DNA研究进展
游离DNA又称为胞外DNA,广泛分布于人血浆、尿液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、羊水和精浆等体液中.目前,已被广泛研究并成为多种疾病无创诊断和研究的新分子标记物.近年来,精浆游离DNA(cfsDNA)在其浓度、分子量大小、来源及存在形式等一般特征和临床应用研究方面取得了一定进展,并在男性特发性不育病因诊断、研究及睾丸生殖细胞肿瘤、前列腺癌的早期诊断、疗效监测和预后评估等方面展示出良好的应用前景.本文概述游离DNA一般特征和生物学功能,并结合cfsDNA的研究现状及应用前景作一综述.
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国产血浆游离DNA提取试剂盒的性能评价
目的:对国产血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)提取试剂盒进行评价.方法:用志愿者血浆构成血浆池A,再分别加入固定量片段长度为102、268、402 bp和所有片段混合物的DNA,形成血浆池B1-B4.用Qiagen和国产柱式法cfDNA提取试剂盒分别提取血浆池A和血浆池B1-B4中的cfDNA.用TaqMan qPCR分析两种试剂盒提取血浆池A中cfDNA的提取效率,同时分析cfDNA浓度与血浆用量之间的关系,用琼脂糖凝胶电泳分析提取的cfDNA的片段完整性.核酸测定仪分析两种试剂盒对血浆池B1-B4中不同DNA片段的回收率.结果:Qiagen和国产试剂盒提取的血浆池A中cfDNA的Ct值分别为27.94±0.423和27.41±0.356,国产试剂盒提取效率明显高于Qiagen试剂盒(t=4.29,P＜0.01);琼脂糖凝胶电泳结果表明,两种方法提取的血浆池A中cfDNA在102、268和402 bp处均出现明显条带,而1 204 bp片段未出现.Qiagen和国产试剂盒提取的cfDNA浓度与血浆池A的血浆用量之间均存在明显的线性相关,r2分别为0.979(P ＜0.01)和0.963(P ＜0.01).Qiagen和国产试剂盒提取的血浆池B1-B4血浆中102、268、402 bp及其昆合物的回收率分别为64.81％ ±4.27％,80.40％±4.31％,88.40％±6.11％,83.50％ ±5.21％和73.50％±5.33％,85.20％±4.49％,89.30％ ±5.91％,85.64％±4.48％,两者在102和268 bp片段的回收率上差异显著(t=5.69,P＜0.01;t =3.44,P＜0.01),而在402 bp及混合物的回收率上无明显差异(t =0.47,P＞0.05;t 1.39,P＞0.05).结论:国产cfDNA提取试剂盒在各项评价性能上均可与Qiagen产品媲美.
