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上调巨噬细胞FcγRⅡB的表达可抑制其吞噬和趋化功能
目的 构建大鼠FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,观察其对巨噬细胞的作用.方法 以大鼠肝脏mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒四环素(Tet)顺式应答元件(TRE),构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒.将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒调节质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和调节病毒,测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度.表达病毒和调节病毒共感染巨噬细胞,经梯度浓度强力霉素(DOX)诱导,免疫荧光技术检测巨噬细胞FcγRⅡB表达,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达.经不同浓度DOX诱导后的腹腔巨噬细胞分别检测吞噬和趋化功能.结果 重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确.表达和调节病毒滴度均达到106转导单位/mL.巨噬细胞被病毒感染后经DOX诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示,FcγRⅡB能够在巨噬细胞表达;实时荧光定量PCR和Western blot结果显示FcγRⅡB表达水平与DOX浓度呈正相关.巨噬细胞的吞噬和趋化功能与FcγRⅡB表达呈负相关.结论 调节巨噬细胞FcγRⅡB的表达可抑制其吞噬和趋化功能.
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含人FcγRⅡB基因慢病毒的制备及其在HT-1080细胞中的表达
目的 构建FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,并鉴定其在细胞中的表达.方法 以人mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE,构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒.将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒可诱导质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和可诱导病毒,分别测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度.表达病毒和可诱导病毒共感染HT-1080细胞,经梯度浓度强力霉素(Dox)诱导,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,免疫荧光染色检测HT-1080细胞FcγRⅡB表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达.结果 重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定,测序结果显示插入片段碱基序列与GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100％.表达病毒滴度达106 TU/mL,可诱导病毒滴度达105 TU/mL,感染性良好.HT-1080细胞被病毒感染后经Dox诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示FcγRⅡB能够在HT-1080细胞中表达;实时荧光定量PCR和Western blot法结果显示FcγRⅡB表达水平与诱导剂浓度正相关.结论 成功制备了FcγRⅡB慢病毒,感染HT-1080细胞后可实现FcγRⅡB的诱导表达.
