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视网膜色素上皮细胞吞噬功能与 MERTK-Ras-肌球蛋白通路关系的研究
目的：：研究视网膜色素上皮( retinal pigment epithelium, RPE)细胞吞噬功能与 MERTK 受体及其下游信号通路Ras-MEK-MLCK-肌球蛋白的关系。方法：用视细胞外节膜盘( rod outer segments,ROS)于37℃孵育离体培养的3~5代C57小鼠RPE细胞,在孵育0、30、60、120、180、240 min终止吞噬反应。双重荧光标记法检测RPE细胞吞噬动力学；以MERTK及Ras抗体、磷酸化MEK及MLCK抗体应用Western-Blot方法检测不同孵育时间(30、60、120、180 min ) MERTK、Ras、MEK 及 MLCK的激活状态；以瞬时转染质粒方法抑制Ras及MERTK基因表达后,再次以 Western-Blot 方法检测对应时间MERTK-Ras通路激活状态及吞噬功能的变化。结果：C57小鼠RPE细胞吞入ROS发生在孵育30min,并在3h达到饱和。在吞噬过程中,随着孵育时间的延长, RPE细胞MERTK、Ras、MEK和MLCK的蛋白表达水平不断增多(与对照组相比,P<0.05)。 Ras及MERTK干扰后的RPE细胞与ROS共孵育(30、60、120、180min)的全过程中,MERTK、Ras、MEK 和 MLCK 的蛋白表达及 ROS 的吞入数量始终维持较低水平,仅在孵育180 min 见到少量ROS吞入；与未转染 RPE 细胞相比, siRas-RPE 细胞及siMERTK-RPE细胞与ROS共孵育120、180min时,MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表达量均明显减少(P<0.05)。结论：Ras-MEK-MLCK-肌球蛋白通路是鼠RPE细胞吞噬过程中MERTK受体激活的下游信号通路。
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传代后视网膜色素上皮细胞MERTK基因表达变化的研究
目的:检测传代后的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)MERTK基因表达的变化,明确传代的异体RPE移植的可行性.方法:离体培养原代的人视网膜色素上皮细胞,将原代细胞以1:3比例进行传代至第6代,以SYBR(R) Green I real time RT-PCR方法检测不同传代数的RPE 细胞MERTK基因表达的水平,采用2-ΔΔCT 方法计算定量PCR的数值进而比较各代MERTK基因表达的的变化.结果:原代及传代的RPE细胞均表达MERTK基因.第二代RPE细胞MERTK基因表达水平与原代相同,第3~6代RPE细胞MERTK基因表达水平均明显低于原代.结论:传代的RPE细胞可以作为异体视网膜色素上皮细胞移植的细胞来源,但以第二代的RPE细胞为佳选择.
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先天性静止性夜盲家系和无色素性视网膜色素变性家系临床表型及突变基因的研究
目的 研究先天性静止性夜盲家系和无色素性视网膜色素变性家系的致病基因突变及临床表型特征.方法 收集在宁夏眼科医院就诊的1个先天性静止性夜盲(CSNB)和1个无色素性视网膜色素变性(RPSP)家系的临床资料,抽取患者家庭成员及其正常对照者外周静脉血,提取DNA;运用外显子结合目标区域捕获测序芯片进行检测,对检测结果进行分析后得到候选致病性突变位点.运用PCR和直接测序进行验证,确定致病性突变位点.结果 CSNB家系有3例患者,自幼夜盲,无进行性加重,ERG表现为暗视ERG,即a波正常、b波显著下降;EOG正常.RPSP家系有3例患者,自幼夜盲,逐渐加重.ERG检查与暗视ERG,a波、b波均重度下降;EOG显示光峰/暗谷明显降低.通过基因检测和生物信息分析,证实TRPM1基因p.R1025L为该家系的致病基因突变,MERTK基因p.R1443W为RPSP家系的致病基因突变.结论 先天性静止性夜盲及无色素性视网膜色素变性根据眼底表现难以鉴别,ERG、EOG检查及结合基因突变检测分析,可为临床诊断提供可靠依据.
关键词： 先天性静止性夜盲 无色素性视网膜色素变性 TRMP1 MERTK
