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土霉素高产菌株N56育种及工业发酵条件优化
目的 以五氟尿嘧啶与紫外线复合氯化锂诱变土霉素产生菌,得到高产突变株.方法 以龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)M-2 4#为出发菌,采用不同工作浓度的五氟尿嘧啶与不同处理时间的紫外线复合氯化锂处理该菌株,经过琼脂块抑菌圈初筛、摇瓶筛选和罐上试验,得到生产性状优良的菌株.结果 经过诱变及各步筛选后,获得3株高产菌株,并根据培养特性对它们进行发酵条件的优化,选出经济高效菌株199#,经过自然分离得到高产稳定的菌株N56,在生产车间进行四批30吨罐发酵的研究,发酵水平提高8.75％,同时节约了无菌空气量11.1％.结论 五氟尿嘧啶与紫外线复合氯化锂诱变土霉素产生菌效果显著,所获得的高产菌株效价高、需氧量低,节约了大量无菌空气,降低了生产成本.
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土霉素原位凝胶的制备及抑菌效果评价
目的 制各土霉素原位凝胶,评价其体外释放度及抗菌效果,可为奶牛子宫内膜炎治疗提供新选择.方法 测定不同浓度泊洛沙姆溶液的初始胶凝化温度和黏度,优化得到适宜浓度的泊洛沙姆和壳聚糖溶液作为原位凝胶基质,制备载土霉素原位凝胶.建立用于土霉素含量测定的高效液相色谱法,采用动态透析法考察土霉素原位凝胶的体外释放特性.以林可霉素凝胶作为阳性对照,考察土霉素原位凝胶的体外抑菌效果.结果 20％(w/v)泊洛沙姆初始胶凝化温度为37℃,胶凝时间7min,黏度为0.097Pa·S,适于局部应用.土霉素原位凝胶具有缓释作用,10h累计释药率可达70％.土霉素原位凝胶抑菌圈为3.3cm±0.1cm.抑菌效果明显.结论 土霉素原位凝胶具有局部停留时间长、可持续发挥药效、使用方便等优点,具有广阔的应用前景.
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HPLC测定土霉素片的含量
目的测定土霉素片的含量.方法采用HPLC法,C18色谱柱,以0.05 ml*L-1草酸铵溶液-二甲基甲酰胺-0.2 mol*L-1磷酸氢二铵溶液(75∶20∶5)为流动相,检测波长280 nm.结果土霉素在0.01～0.15 mg*ml-1范围内呈良好的线性关系,回归方程为:Y=2.54×107X+2.15×104(r=0.9996,n=7).平均加样回收率为98.7%(RSD=1.13%,n=5).结论方法简便、快速、准确.
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土霉素加速破坏降解产物的LC-MS研究
目的建立土霉素及降解产物的LC-MS方法,分析土霉素在各种加速破坏条件下的降解产物,探讨其可能的降解途径.方法通过加速实验制备实验样品,利用分析柱,经柱后分流,电喷雾电离和选择性离子检测,分析降解产物和降解途径.结果在弱酸、强酸、强碱、加热和氧化5种破坏条件下,土霉素可以产生多种降解产物,其主要降解产物为4-差向土霉素(4-epi-oxytetracycline EOTC)、脱水土霉素(anhydrooxytetracycline AOTC)、α-原土霉素(α-Apo-oxytetracycline α-APOTC)、β-原土霉素(β-Apo-oxytetracycline β-APOTC)、异土霉素(isooxytetracycline IOTC).结论建立的LC-MS方法可用于该类降解产物及降解途径研究,所确定的降解产物及降解途径为该品种质量控制和稳定性研究提供了重要依据.
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多种超滤膜和纳滤膜在土霉素提取中的性能比较
采用10种超滤膜和3种纳滤膜进行土霉素提取的实验研究.实验结果表明截留分子量6万的PS-60超滤膜的通量大,并且透过效价多;由安得公司提供的PES-10超滤膜在土霉素分离中具有特殊的性能,对土霉素的截留率较大,但透过液结晶色泽较好,且母液中土霉素含量低,损失少.三种纳滤膜中PS复合纳滤膜通量大,效价损失少,还可去除部分小分子色素.经纳滤后结晶的土霉素粉末色泽好于超滤液结晶粉末,且母液中损失的土霉素较少,说明纳滤有利于减少结晶过程土霉素损失.
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应用超滤法从发酵液中提纯抗生素
土霉素的生产包括酸化、过滤、脱色和结晶等步骤,多年来土霉素的提纯技术一直没有大的改变.常用的树脂脱色过程成本高,收率低,还因树脂再生产生酸、碱废水而增加污水处理费用.本研究试用超滤取代树脂脱色单元操作以克服其上述缺点.在实验中使用了切割分子量为4960.5u的超滤膜,实验结果表明超滤是取代树脂脱色的有效手段,可以充分纯化土霉素结晶液并改善结晶,脱色过程收率由树脂法的95.3%提高到98.6%.如果超滤与净化剂预处理相结合,可以提高土霉素质量,并使土霉素结晶收率由90.58%提高到93.3%.
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液膜技术分离回收发酵废液中土霉素的试验研究
在萃取的基础上,进行了乳状液膜分离萃取发酵废液中土霉素的试验研究.液膜体系组成为:氯代十六烷基吡啶(PCC)为载体,Span-80为表面活性剂,异辛醇为助溶剂,煤油为稀释剂,盐酸水溶液为膜内相.通过试验考察了液膜组成、膜内比(Roi)、表面活性剂用量、内相HCl浓度、萃取搅拌速度、外水相pH、以及乳水比(Rew)和萃取时间等因素对萃取率的影响,找出了一个较为适宜的液膜组成和萃取操作的工艺条件,对发酵废液中土霉素的萃取率达到61.33%.
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从结晶母液中萃取土霉素的试验研究
采用萃取法提取结晶母液中残存的土霉素,研究了各种因素对萃取过程和萃取分配系数和萃取率的影响.试验结果表明,采用异辛醇为溶剂,氯代十六烷基吡啶(PCC)为载体,在常温、弱碱性条件下可得到较高的萃取分配系数和萃取率,有效回收母液中的土霉素.萃取法处理土霉素结晶母液工艺简单、效率高,具有良好的经济和环境效益.
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膜分离法回收土霉素结晶母液中的土霉素
土霉素结晶母液经超滤膜预处理后,通过反渗透膜所得浓缩液,再经超滤膜处理后,15%氨水调pH值从土霉素结晶母液回收土霉素,得到的土霉素纯度82.9%,效价771u/mg,回收率62%.此结晶母液为二次母液,与车间冲洗水等混合后可较容易地进行生物降解.
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高纯度土霉素碱制备工艺研究 Ⅱ.土霉素新产品中2-乙酰-2-去酰胺土霉素的去除
2-乙酰-2-去酰胺土霉素(ADOTC)是土霉素发酵过程中产生的共生物杂质,母环结构与土霉素(OTC)相同,所以很难去除.本文提出的沉淀分离方法,根据A酸能与ADOTC和OTC形成不同溶解度的络合物的性质,使沉淀和溶液分开,因而能有效地把OTC中的ADOTC分离出来,且加入K4Fe(CN)6-ZnSO4净化超滤后使OTC的HPLC测定纯度由96.14%提高到98.72%,ADOTC含量由1.89%下降到0.37%.
关键词： 土霉素 2-乙酰-2-去酰胺土霉素 沉淀法 纯度 -
龟裂链霉菌原生质体诱变与筛选研究
采用定向推理筛选方法对龟裂链霉菌原生质体进行诱变筛选得到346#菌株,其复筛时比对照产量高7%,而在60吨大罐上连续发酵9批,发酵指数比对照高了13%.
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土霉素生物合成研究进展
本文介绍了近年来土霉素的生物合成研究进展,包括基因簇结构、土霉素分子调控等,以及运用基因工程和组合生物合成原理创造新型土霉素结构类似物的前景.
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HPLC-DAD法同时检测抗炎类中药制剂中非法掺入的6种四环素类抗生素
目的 建立同时检测抗炎类中成药中非法掺入四环素类抗生素的专属性方法.方法 采用HPLC-DAD法.色谱柱为Agilent C18柱(250mm×4.6mm,5μm),醋酸盐缓冲液[取醋酸铵17.36g,乙二胺四醋酸二钠3.35g,加水适量溶解后,加三乙胺9mL,加水至1000mL,用醋酸调节pH至8.8]-乙腈(88:12),流速1.2mL/min;柱温35℃.检测波长280nm.通过液相色谱保留时间和紫外光谱信息,对消炎类中成药的提取液进行定性鉴别和定量测定.结果 土霉素、美他环素、β-多西环素、多西环素、盐酸四环素、盐酸金霉素的线性范围分别为11.6～232.4μg/mL(r=0.9998),12.7～190.9μg/mL(r=0.9995),105.0～862.0μg/mL(r=0.9997),20.50～410.0μg/mL(r=0.9987),23.28～598.4μg/mL(r=0.9990),48.60～971.6μg/mL(r=0.9989).平均加样回收率(n=6)分别为98.3％,97.5％,96.2％,98.4％,101.1％,96.1％; RSD分别为1.2％,0.5％,0.9％,1.5％,0.8％和1.9％.结论 该方法操作简单,重复性好,可作为分析中药抗炎制剂中非法掺入土霉素、美他环素、β-多西环素、多西环素、盐酸四环素、盐酸金霉素的有效检测方法.
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氮离子注入土霉素产生菌诱变高产菌株的研究
以土霉素生产菌株48#为出发菌株,采用氮离子注入诱变处理,经摇瓶筛选,得到土霉素02-2-44#菌株.该菌株特性优良,经57m3发酵罐试验,150批平均发酵效价高于对照菌株(1158.6μg/ml),提高3.42%,发酵总亿及发酵指数分别提高3.17%和3.99%.
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用紫外线及2-脱氧D-葡萄糖改良产土霉素菌
目的 改善产土霉素菌的生产特性.方法 紫外线诱变、在含有2-脱氧-D-葡萄糖的培养基中选育.结果 紫外线照射30s的剂量下致死率适合做育种.在此基础上,诱变后选育出了一株高产菌株,编号9-15#,其摇瓶效价比原菌株提高了13.0％,上罐试生产提高6.1％.结论 紫外线照射结合2-脱氧-D-葡萄糖的培养基中筛选可以获得高产土霉素的龟裂链霉菌菌种.
关键词： 土霉素 紫外线 2-脱氧-D-葡萄糖 龟裂链霉菌 诱变育种 -
耐受高用量GPE型消泡剂土霉素菌株的选育
目的 土霉素的发酵过程中,消泡剂的添加会对龟裂链霉菌产生抑制作用,为此本论文研究选育耐受高用量GPE型消泡剂的土霉素菌株.方法 采用紫外诱变的方法,对菌株进行消泡剂耐受性筛选,再经摇瓶初筛、复筛,考察菌株的效价值及其传代稳定性.结果 筛选到的耐受GPE型消泡剂土霉素菌株在高消泡剂浓度(即10倍消泡剂浓度)下,仍然不影响菌株效价,而出发菌株在10倍消泡剂浓度下土霉素产量显著下降,下降了76.1％.且该耐受消泡剂土霉素菌株传代稳定性较好.结论 本实验所得耐受高用量GPE型消泡剂土霉素菌株与出发菌株比较,对消泡剂的耐受性有了很大提高.
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土霉素结晶工艺改进的研究
为缩短结晶时间,提高结晶设备的利用率,本文研究了结晶过程中影响晶型的各种因素,改进了发酵液预处理、结晶工艺.试验结果表明,在控制发酵液酸化pH值1.95～2.05、黄血盐钠加量0.3%、黄血盐钠和硫酸锌配比3:2、结晶温度等条件,找到了一个较为适宜的发酵液预处理和结晶工艺,在结晶时间仅为47min的情况下,可明显改善土霉素晶型,使晶体粒度分布均匀,产品内在质量得到进一步提高.
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链霉菌I03A00601代谢产物中抗分枝杆菌活性成分研究
目的 从链霉菌I03A00601代谢产物中分离纯化抗分枝杆菌活性成分.方法 通过活性追踪,利用多种色谱技术进行分离纯化活性成分,通过现代波谱学方法鉴定其结构.结果 从中分离得到2个化合物,其结构分别确定为土霉素(1)和黄豆苷元(2).结论 土霉素为该菌株发酵液抗分枝杆菌活性成分.通过2D NMR实验准确归属了上霉素游离碱在溶液中的NMR数据,由13C-NMR数据证实土霉素游离碱在非水溶液中为非离子型构象.
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时间分辨荧光法高通量筛选鱼肉组织中土霉素的残留量
目的 动物组织中抗生素残留量的测定一般需要多步骤的样品处理过程.本文介绍了一种全新的、简便和快速筛选鱼肉中土霉素残留量的方法.采用固相萃取和时间分辨荧光(time resolved luminescence,TRL)技术,无须离心和过滤,简化了分析过程.方法 将C18小片浸在组织匀浆液中提取和富集20min,取出,在水中浸泡3min,接着浸在TRL试剂溶液中2min,后取出干燥,干燥后,在C18小片表面上直接进行荧光测定.结果 土霉素在0～8μg/g的范围内,仪器信号的响应与浓度呈现良好的线性关系(r2=0.9992),检测限为0.026μg/g,采用本法对45个加标准液的样品(浓度范围在0～4μg/g)进行分析,其中41个样品的定性结果正确,只有4个样品定性结果显假阳性.结论 本方法简便,快速,准确,适用于鱼肉组织中土霉索的高通量筛选分析.
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HPLC 法测定土霉素片中的土霉素含量
目的：建立高效液相法测定土霉素含量的方法。方法：采用 Agilent －C18（4.6mm ×250mm，5μm）色谱柱；流动相：醋酸铵溶液－乙腈（85∶15）；检测波长：280nm；流速：1.0ml ／min；柱温：30℃。结果：土霉素在0.12－9.6μg 范围内线性关系良好，r ＝0.9999，平均回收率为99.2％，RSD ＝0.6％（n ＝6）。结论：该方法简便、准确、灵敏度高、重现性好，适用土霉素片的质量控制。
