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过氧乙酸对MS2噬菌体灭活效果的初步观察
目的 研究过氧乙酸消毒剂对MS2噬菌体的灭活效果.方法 采用悬液定量灭活试验方法进行了实验室观察.结果 用浓度为200 mg/L的过氧乙酸消毒剂溶液作用60 min,对悬液内MS2噬菌体的平均灭活对数值为2.49.用浓度为1 200、800、500 mg/L的过氧乙酸溶液分别作用15、30和60 min,对悬液内MS2噬菌体的平均灭活对数值达到4.0以上.结论 在本试验条件下,较低浓度的过氧乙酸溶液对MS2噬菌体灭活效果较好.
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噬菌体MS2和f2对消毒剂二溴海因抵抗力研究
目的 研究噬菌体MS2和f2对消毒剂二溴海因的抵抗力,探讨肠道病毒灭活效果的指示病毒.方法 采用病毒悬液定量灭活试验方法,比较两种噬菌体对二溴海因的抗力.结果 浓度为250 mg/L二溴海因消毒液作用5 min和10 min,对MS2噬菌体的灭活对数值分别为3.87和4.36.相同浓度的二溴海因消毒液作用5min和10 min,对f2噬菌体的灭活对数值为3.25和3.48.二溴海因对f2噬菌体灭活对数值达到4.0以上,需要提高浓度到375 mg/L,且需要作用10 min.结论 研究证明,f2噬菌体对二溴海因抗力明显高于MS2噬菌体.
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载银纳米二氧化钛残留物去除及其对MS2噬菌体灭活效果的研究
目的 研究载银纳米二氧化钛对噬菌体MS2的灭活效果.方法 采用悬液定量灭活试验,对载银纳米二氧化钛水溶液对噬菌体MS2的灭活效果进行了观察.结果 用40 g/L的硫代硫酸钠溶液作为中和剂对500 mg/L载银纳米二氧化钛消毒剂残留物达不到中和效果,不能满足判定标准要求.用离心法按照8000 rpm离心10 min,可在不损失噬菌体MS2的情况下去除500 mg/L载银纳米二氧化钛对噬菌体的作用,以此替代中和剂法.在自然光下,载银纳米二氧化钛的浓度为50 mg/L作用2 min,其对噬菌体MS2灭活对数值均＞4.结论 载银纳米二氧化钛在自然光照下对噬菌体MS2 的灭活效果较好.
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二溴海因对MS2噬菌体和脊髓灰质炎病毒 Ⅰ型疫苗株杀灭效果研究
目的 比较MS2噬菌体和脊髓灰质炎病毒I型(Poliovirus-I,PV-I)对二溴海因消毒剂的抵抗力大小,筛选用于评价消毒因子灭活肠道病毒效果的指示病毒.方法 参考2002年版《消毒技术规范》,灭活病毒效果的评价采用病毒悬液定量灭活试验设计,分别对MS2噬菌体和PV-I进行病毒灭活试验.结果 二溴海因消毒剂的浓度250 mg/L、作用10 min和375 mg/L、作用5 min,对MS2噬菌体的灭活对数值分别达到4.04和6.11.二溴海因消毒剂的浓度500 mg/L、作用20 min和375 mg/L、作用50 min,对PV-I的灭活对数值分别达到4.42和4.27.相同浓度(375 mg/L)的二溴海因消毒剂灭活病毒MS2噬菌体和PV-I达到消毒水平(灭活对数值≥4.00)的浓时积值(C·t)分别为1875 mg·min/L和18750 mg·min/L.结论 病毒MS2噬菌体对二溴海因的抵抗力弱于PV-I.
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含组氨酸标签的甲/乙型流感嵌合体假病毒颗粒的构建和表达
为了获得内含甲/乙型流感病毒部分序列的病毒样颗粒,本研究通过定点突变技术将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的p发夹环结构中,建立通用表达载体D-pET32a-CP-his.并采用聚合酶链反应扩增甲/乙流病毒cD-NA的部分保守区域,将两种病毒的嵌合体基因序列连接到表达载体,转化BL21细胞.经诱导表达和镍柱亲和层析纯化,获得了含有甲/乙型流感病毒部分序列的高浓度和纯度的病毒样颗粒.该病毒样颗粒在4℃和-20℃条件下可稳定保存.本研究构建带有组氨酸纯化标签假病毒的通用表达载体,可以作为以后构建和制备耐RNase的mRNA标准品和质控品的平台;构建的甲/乙型流感嵌合体假病毒可为实验室流感病毒的检测提供新的标准品及质控品.
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MS2噬菌体在贝类食源性病毒检测中过程质控应用
目的 研究MS2噬菌体作为过程质控品在贝类食源性病毒检测中的应用.方法 采用双层琼脂培养法制备MS2噬菌体悬液,计算效价;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检验其稳定性;比较3种RNA提取方法的提取效率,确定MS2噬菌体的适添加量范围;分析MS2噬菌体添加对贝类食源性病毒检测的影响.结果 稳定性研究表明-20℃和-80℃28 d MS2噬菌体(悬液的效价浓度为7.13×1011 pfu/mL)时RNA含量无明显变化[t =0.464,P=0.653(-20℃);t=0.602,P=0.561(-80℃)].MS2噬菌体适添加量范围为7.13 ×108 ～7.13×107 pfu/mL.在适添加范围内,试剂盒方法和Trizol裂解结合磁珠纯化方法回收率均＞1％.2种阳性样品均被检出,其Ct值比较接近,MS2噬菌体对贝类食源性病毒检测无影响(t=0.170,P=0.873).结论 MS2噬菌体可作为贝类食源性病毒qRT-PCR检测的过程质控品,是监控假阴性结果的一种简便有效的方法.
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含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒样颗粒的制备及应用
目的 构建耐RNase酶的内含禽流感病毒H5N1亚型部分核酸序列的病毒样颗粒.方法 构建中间载体 pET32a-MS2,将禽流感病毒H5N1亚型的HA、NA和M基因片断连接到中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA和pET32a-MS2-M,分别转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒.结果 表达载体经PCR、酶切鉴定和测序分析后证实构建成功.电镜观察到了病毒样颗粒,荧光定量RT-PCR试验表明颗粒稳定性良好.结论 成功构建了含禽流感病毒H5N1部分核酸序列的病毒样颗粒且稳定性良好,可作为禽流感H5N1亚型RNA检测的标准品和质控品.
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含甲型H1N1流感病毒HA基因序列病毒样颗粒的制备
[目的]构建耐RNase酶的内含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒.[方法]构建中间载体pET32a-MS2,将甲型H1N1流感病毒的HA基因片段连接中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒,对病毒样颗粒进行荧光定量RT-PCR检测和稳定性实验.[结果]表达载体经PCR、酶切鉴定分析后证实构建成功,荧光定量RT-PCR实验表明该病毒颗粒含有HA基因片段并且颗粒稳定性良好.[结论]成功构建了含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒且稳定性良好,有望作为甲型H1N1流感病毒RNA检测的标准品和质控品.
关键词： MS2噬菌体 甲型H1N1流感病毒 病毒样颗粒 原核表达 -
含肠道病毒71型VP1基因片段RNA病毒样颗粒的构建
[目的]构建含肠道病毒71型(EV71)VP1基因片段的抗核糖核酸酶的病毒样颗粒.[方法]利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2.将EV71 VP1基因片段连接到中间载体噬菌体基因的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV71.将重组质粒pET32aMS2-EV71转化宿主菌,经IPTG诱导表达获得病毒样颗粒,对病毒样颗粒进行透射电镜观察、RT-PCR检测和稳定性试验.[结果]重组质粒pET32a-MS2-EV71经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功;透射电镜观察到直径大约23 nm的圆形病毒样颗粒;RT-PCR和稳定性试验结果表明,诱导产生的病毒样颗粒含EV71 VP1基因片段,并且稳定性良好.[结论]成功构建了含EV71、VP1基因片段的病毒样颗粒,稳定性良好,可作为病毒检测时标准品和质控品使用.
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MS2和T4噬菌体对短波紫外线抵抗力的比较研究
[目的]观察MS2和T4两种噬菌体对短波紫外线(UVC)抵抗力的变化,确定不同强度UVC有效灭活两种噬菌体的时间,为寻找适噬菌体作指示病毒用于UVC灭活病毒效果的评价提供依据.[方法]噬菌体悬液在一定紫外线强度下照射不同的时间,后采用双层琼脂平板法分别测定照射前后的噬菌体滴度,绘制照射前后噬菌体的灭活曲线(t-△log),并在不同紫外线强度下进行测定.[结果]MS2噬菌体在UVC照射下:370μW/cm2,10min,或680μW/cm2,5 min,或1 130μW/cm2,3 min,达到消毒水平(LIV≥4.00 log10),UV分别为4.49 log10、4.52 log10和4.16 log10;T4噬菌体则为370μW/cm2,20 min,或680μW/cm2,15 min,或1 130μW/cm2,5 min,达到消毒水平,LIV分别为4.60 log10,4.02 log10和5.46 log10.[结论]在本实验条件下,对短波紫外线的抵抗力:T4噬菌体＞MS2噬菌体.
