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中国结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型方法标准化操作程序的探讨
目的 探讨中国结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)的标准化方法,初步评价其应用价值.方法 采用核酸提取、聚合酶链反应(PCR)、反向线性点杂交等技术,结合BioNumeries(Version 5.0)软件,对224株结核分枝杆菌临床分离株进行分型研究.结果 使用Spoligotyping标准化方法 对224株中国结核分枝杆菌临床分离菌株进行基因分型,将其分为北京家族菌株和非北京家族菌株两大簇.其中北京家族菌株129株,为主要的流行菌株.结论 初步确定中国Spoligotyping标准化技术方案.该方法 快速、简便、重复性好,能同时对结核分枝杆菌进行检测和分型,有利于结核病传染源的追溯和流行趋势的研究,尤其是在鉴定北京家族菌株上具有独特作用.
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江苏省260株结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型研究
目的 研究江苏省结核分枝杆菌DNA指纹图谱的分布特征,分析北京家族株与结核分枝杆菌耐药的关联性.方法 江苏省30个耐药监测点收集260株结核分枝杆菌分离株,应用比例法检测分离株对于一线抗结核药物(异烟肼、链霉素、利福平和乙胺丁醇)的耐药性,应用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)方法进行基因分型,使用BioNumerics 5.0软件进行聚类分析,并与SpolDB4数据库比对.结果 260株结核分枝杆菌分离株可分为34个基因型(27个独特基因型和7个共享基因型),菌株经聚类分析分为两个家族:北京家族(80.4％,209/260)和非北京家族(19.6％,51/260).logistic回归分析显示,北京家族株能增加结核分枝杆菌耐多药的发生风险(OR=11.07,95％CI:1.45～84.50).非北京家族包括T1、T2、H3、H4、CAS、LAM、U和MANU2,其中CAS、LAM和MANU2家族在中国比较罕见,在江苏省是首次报道.结论 江苏省结核分枝杆菌流行株具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族,且该家族可能与结核分枝杆菌耐多药之间存在关联.
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江西省MDR-TB的MIRU-VNTR分型研究
目的 调查江西省耐多药结核分枝杆菌MIRU-VNTR分子特征及传播情况. 方法 分离自江西地区的耐多药结核分枝杆菌131株,采用15位点MIRU-VNTR进行RD105片段缺乏(北京基因行)检测;进行分型,计算等位点差异、分辨率、成簇率以及近期感染率的估算值. 结果 江西地区人感染耐多药结核分枝杆菌中北京基因型占 83.21％.分离株结核分枝杆菌15位点MIRU-VNTR的HGI值为0.9947,北京家族菌为0.9923.131株菌共分为11个基因簇和98个孤立基因型,成簇率为25.19％,近期感染率估计值为16.79％;北京家族株成簇率为28.44％,近期感染率估计值为19.27％. 结论 15位点MIRU-VNTR对包括北京家族株结核分枝杆菌的分辨率高,该方法适合于江西地区耐多药结核分枝杆菌的基因分型.江西省耐多药结核病的流行主要为内源性复燃,但近期传播仍不能忽视.
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一种鉴定结核分枝杆菌"北京家族"菌株的新方法
目的 研究结核分枝杆菌"北京家族"菌株鉴定的新方法——RD105缺失检测的可行性.方法 分别应用间隙寡核苷酸分型(Spoligotyping)和RD105缺失检测两种方法对结核分枝杆菌进行"北京家族"的鉴定,比较分析两种方法进行菌株鉴定结果的差异.结果 共对来自北京、福建、新疆和吉林的342株结核分枝杆菌临床分离菌株进行了鉴定,"北京家族"菌株261株,占76.32%.非"北京家族"菌株81株,占23.68%.两种方法鉴定结果的符合度达100%.结论 简单、快速的新方法——RD105缺失检测可替代原始经典方法Spoligotyping用于结核分枝杆菌"北京家族"菌株的鉴定.
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四川省106株结核分枝杆菌spoligotyping基因分型研究
目的 了解四川省结核分枝杆菌基因型构成情况以及北京基因型菌株在四川省结核分枝杆菌中所占的比例,为四川省结核病预防控制提供分子流行病学依据.方法 采用间隔区寡核苷酸分型( spacer oligonucletide typing,spoligotyping)方法对106株四川省结核分枝杆菌进行分型分析,将spoligotyping分型结果与SITVIT2数据库进行比较确定菌株的基因家族.结果 根据spoligotyping分型结果及与数据库SITVIT2的比较,106株结核分枝杆菌表现为30种基因型,21种基因型为数据库中存在的基因型,9种基因型为新的基因型.基因家族分析发现,65株结核分枝杆菌为北京家族菌株(61.32％),26株为T家族菌株,4株为MANU家族菌株,U型及H型家族菌株各1株.9株新基因型的菌株没有进行基因家族的确定.结论 本研究对四川省结核分枝杆菌的基因型构成以及北京家族菌株的流行程度做了初步的描述.对四川省结核病的流行趋势分析、结核病的预防控制等具有重要的意义.
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多位点可变数量串联重复序列分析在北京家族结核分枝杆菌基因分型中的应用及位点筛选
目的 对于北京家族菌株占绝大多数的感染人群,评价多位点可变数量串联重复序列(variable number tandem repeats,VNTR)分析(multiple loci VNTR analysis,MLVA)中不同位点组合在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)基因分型研究中的应用.并以IS6110限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)为参照,筛选有效位点.方法 分别采用IS6110-RFLP、间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及MLVA不同位点组合对北京海淀区收集的MTB临床分离株进行基因分型研究,比较3种方法及MLVA不同位点组合的分型效果.结果 45株MTB分离株中86.7%为北京家族菌株,Spoligotyping和结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterial interpersed repetitive units,MIRU)-12系列的HGI(Hunter-Gaston Index)值分别为0.4313和0.8700,将45株MTB菌株分为10个和23个基因型.VNTR-9系列和IS6110-RFLP的分型结果一致,HGI值较高,为0.9980,将45株MTB菌株分为43个基因型.结论 北京家族结核分枝杆菌在北京海淀区呈高水平流行.对于北京地区北京家族菌株占绝大多数的感染人群,VNTR-9系列MLVA是较为简便和高分辨率的分型方法,其分辨率能够达到MTB基因分型"金标准"IS6110-RFLP水平.
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四川省川南地区结核分枝杆菌Spoligotyping分型研究
目的 了解四川省川南地区结核分枝杆菌基因型构成情况,为结核病防控提供分子流行病学依据.方法 采用间隔区寡核苷酸分型(Spacer Oligonucletide typing,Spoligotyping)方法对四川省川南地区267株临床分离菌株进行基因分型,结果采用BioNumerics(Version 5.10)软件进行分析,并将Spoligotyping分型结果与SpolDB4.0数据库中的菌株进行比对分析.结果 267株结核分枝杆菌表现出66种基因型,其中51株表现为独特基因型,其余216株可聚为10个基因簇.与SpolDB4数据库比对分析发现,267株结核分枝杆菌中,144株为北京家族菌株(53.93％),79株为T家族菌株(29.59％),9株为H家族菌株,3株为U家族菌株,2株为MANU家族菌株,其余30株表现的基因型为数据库中不存在的基因型.结论 四川省川南地区结核分枝杆菌存在较高的基因多态性,北京家族菌株和T家族菌株为主要的流行菌株,应加强对这两类菌株的流行趋势的监测及生物学特性研究.
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Spoligotyping和MLVA用于71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株基因分型的初步研究
目的 初步探讨寡核苷酸分型(Spoligotyping)和多位点数目可变串联重复序列分析(MLVA)用于浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株的分型,以初步了解浙江省结核分枝杆菌的基因型特征.方法 随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株,常规培养,收集菌体,提取基因组DNA.采用聚合酶链反应(PCR)扩增整个DR区进行Spoligotyping分型,同时分别扩增15个VNTR位点进行MLVA分型.聚类分析采用BioNumerics 软件.统计学分析采用卡方检验.结果 对70株菌进行了基因分型,Spoligotyping结果显示,可分为2个基因群,即北京家族 (Beijing family)和非北京家族(Non-Beijing family),分别占70%和30%,49株北京家族菌株中,89.8%为典型北京家族;MLVA结果显示,可分4个基因群,分别为Ⅰ群占8.5%,含5个基因型,Ⅱ群占18.3%,含13个基因型,Ⅲ群占70.4%,含38个基因型,Ⅳ群占2.8%,含2个基因型.两种方法对菌株的基因分型结果非常吻合,Spoligotyping分型为北京家族的菌株均分布在MLVA Ⅲ型中,非北京家族菌株的基因多态性,分属于MLVAⅠ、Ⅱ和Ⅳ型.MLVA将70株菌分为58个基因型(含53个独特基因型),而Spoligotyping只分为18种基因型(含12个独特基因型).结合对临床一线4种药物的耐药检测结果分析,两种方法的分型结果均显示北京家族菌株中表现为全敏感者71.4% (35/49),表现为耐药者为28.6%(14/49);而非北京家族菌株中表现为全敏感者为66.7%,表现为耐药者为33.3%,经卡方检验,两者间的差异无统计学意义 (χ2=0.158,P>0.05).结论 初步证实浙江省结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为北京家族.北京家族与耐药无明显相关性.MLVA株水平鉴定能力明显高于Spoligotyping, 尤其是在鉴别北京家族菌株上具有明显的优势.
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河南省结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型技术的应用研究
目的 研究间隔区寡核苷酸序列(Spoligotyping)基因分型技术在河南省结核病分枝杆菌基因分型中的应用,了解河南省基因型种类和分布以及北京家族基因型在河南省的分布特征.方法 应用2007年在河南省结核病防治机构实验室分离培养的310株结核分枝杆菌,设计引物,应用PCR和间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术对结核分枝杆菌进行分型检测分析,基因分型分析经http://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces网站分析,统计学数据经卡方检验.结果 对310株结核分枝杆菌临床分离株的Spoligotyping结果显示分为4个基因群(Beijing和Beijing近似群、T群、Manu群、S群),24个基因型,有267株为北京家族基因型,占86.1％,且北京家族基因型与MDR耐药有相关性;河南省较年轻人群(＜60岁)感染的结核分枝杆菌中,北京家族基因型所占比例高于年老组(即＞ 60岁组),北京家族基因型与年轻组的联系强于年老组;北京家族基因型的分布在不同的地区间有差异.结论 河南省结核分枝杆菌以北京家族基因型为主要流行型,且与耐药及年龄、地域有相关性,重点监测北京家族基因型.
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RD105基因缺失法和双重PCR法对125株结核分枝杆菌菌株基因分型检测
目的 为明确比较RD105基因缺失法和双重PCR法对辽宁地区结核分枝杆菌中北京家族菌株的检测能力,同时掌握辽宁地区结核杆菌中北京家族菌株的流行情况而进行该项研究.方法 选取2011-2013年间辽宁省内各地市临床分离菌株,随机抽取经传统方法菌种鉴定为结核分枝杆菌的菌株,共计125株.选用超声破碎法提取菌株DNA,应用RD105基因缺失法和双重PCR法,同时对收集到的125株结核分枝杆菌进行特异性扩增,后使用琼脂糖凝胶水平电泳对扩增的结果进行判断.结果 两种方法判断标准为:RD105基因缺失法结果中,出现283 bp大小片段的为北京家族菌株,不出现特异性条带的为非北京家族菌株;双重PCR法结果中,只出现393 bp大小片段的为北京家族菌株,而只出现570 bp大小片段为非北京家族菌株.使用上述两种方法鉴定本研究的125株结核分枝杆菌,结果完全相同,其中北京家族菌株有110株(88％),非北京家族菌株有15株(12％).结论 RD105基因缺失法和双重PCR法对辽宁地区结核分枝杆菌中北京家族菌株的检测能力相当,并且北京家族菌株在辽宁地区流行的结核分枝杆菌中为绝对优势株;两种方法相对于传统的Spoligotyping法更简单、更省时,检测成本也较低,更适合在我国多数实验室推广应用.
关键词： 结核分枝杆菌 北京家族 RD105基因缺失法 双重PCR法 -
陕西省87株耐药结核分枝杆菌寡核苷酸基因分型和耐药性分析
目的 对陕西87例耐药结核分枝杆菌进行分型研究,了解不同基因型在陕西的流行情况及耐药相关性.方法 收集陕西省结核分枝杆菌耐药菌株87株,采用Spoligotyping方法对结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型.结果 87株耐药结核分枝杆菌中北京家族占86.21％(75/87),非北京家族占13.79％(12/87);非北京基因型中,T家族(T1、T2、T2-3、T3)占9.20％(8/87),Manu家族占1.15％(1/87),新发现基因型占3.45％(3/87).北京家族和非北京家族的单耐药、多耐药、耐多药、其他类型耐药比率分别为38.67％(29/75) 、13.33％(10/75) 、42.67％(32/75) 、5.33％(4/75)和66.67％(6/9) 、11.11％(1/9) 、22.22％(2/9) 、0.00(0/3),差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 陕西省结核分枝杆菌呈基因多态性,其主要流行基因型为北京家族;北京家族和非北京家族的耐药性差异无统计学意义.
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厦门市临床分离的466株结核分枝杆菌基因分型研究
目的 了解厦门市结核分枝杆菌基因类型分布及主要流行基因群情况,并建立分型数据库.方法 采用实时荧光PCR法对厦门市2013-2015年分离到的466株结核分枝杆菌临床分离株进行菌株确认,然后采用间隔区寡核苷酸分型方法(spoligotyping)对其进行基因分型.分型结果与SpolDB4数据库进行比对,并使用Bionumeric6.6.4软件进行基因聚类分析.结果 466株菌均为结核分枝杆菌,基因分型分成96种基因型别,62种数据库中有相应的SIT编号,34种为新的型别.97.64％(455/466)的菌构成了15个基因簇.466株菌属于7个基因家族及未定义家族,排在前三的分别为:Beijing(北京)家族60.09％(280/466)、T家族21.03％(98/466)、H家族5.58％(26/466).结论 厦门市结核分枝杆菌基因型别呈现多样性,北京家族为主要的流行基因群.
