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大鼠泰泽氏菌套式PCR方法的建立和初步应用
根据秦泽氏菌rDNA序列设计出二对特异引物,以标准菌RJ株和大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌纯化的DNA为模板,进行套式PCR反应.结果用外引物扩增,泰泽氏菌和大肠杆菌均出现625 bp的反应带,其它细菌无反应带;而用内引物第二次扩增,只有泰泽氏菌出现196 bp的特异扩增带.将PCR方法应用于人工免疫抑制的SD大鼠,检出率为30%(9/30),同时将此30份血清用间接免疫荧光法(IFA)进行检测,结果未检出阳性样品.结果提示,套式PCR方法具有特异性强、敏感性高,简便快速的特点.
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套式聚合酶链反应检测HTLV-I DNA方法的建立与初步应用
目的建立一种简便、快速的人类嗜T-淋巴细胞病毒Ⅰ型(HTLV-I)DNA检测方法并用于标本检测.方法采用快速法制备DNA模板,以HTLV-Ⅰ基因组pX区特定片段为靶基因,设计并合成引物,建立套式聚合酶链(PCR)检测方法.结果用该法检测献血者标本1 009例,阳性16例;检测经明胶颗粒凝集试验(PA)呈抗-HTLV-Ⅰ阳性标本36例,阳性12例;检测已知HTLV-Ⅰ DNA阳性标本10例,结果均阳性.结论该法具有快速、简便、特异性好等优点,具有推广应用价值.
关键词： 人类嗜T-淋巴细胞病毒Ⅰ型 套式PCR -
病毒性心肌炎患者血白细胞中肠道病毒的检测及意义
目的建立肠道病毒(EVs)检测方法,探讨EVs感染与心肌损伤的关系.方法用套式逆转录聚合酶链反应(nPCR)方法,对225例临床拟诊病毒性心肌炎(VMC)患者血白细胞中EVsRNA进行检测,并用ELISA方法检测患者血清心肌肌钙蛋白I(cTnI).结果 46例EVs-RNA阳性,检出率为20.4%;13例正常对照均阴性.EVs-RNA阳性患者血清cTnI水平(13.3±12.3ng/ml)略高于EVs-RNA阴性患者血清cTnI水平(11.6±13.7ng/ml).14例EVs-RNA阳性患者随访4个月,血清cTnI水平从19.7±9.8ng/ml增至32.0±8.5ng/ml,呈明显增高趋势.结论 nPCR方法是检测EVs感染的可靠方法.EVs-RNA的存在可能是心肌炎不良愈后的指标之一.
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无偿献血者外周血单个核细胞肺炎衣原体的测定及意义
目的: 调查军队某部无偿献血者外周血单个核细胞(PBMC)中肺炎衣原体(CP)的感染状况. 方法:用套式PCR技术检测PBMC中的CP-DNA. 结果: 100例无偿献血者中32例阳性. 结论:军队某部无偿献血者中有较高的CP携带率,其在输血工作中的意义有待探讨.
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类风湿关节炎者解脲脲原体及人型支原体感染
目的了解类风湿关节炎患者解脲脲原体和人型支原体感染状况. 方法自36例患者的咽部、睑结膜部、泌尿道及血液、关节液采取标本,应用nPCR进行解脲脲原体和人型支原体核酸检测. 结果 36例患者中有11例至少1个部位检出1种支原体,占30.6%,其中泌尿道、咽、睑结膜、血液的阳性检出率依次分别为38.5%、17.2%、9.1%和3.4%. 结论类风湿关节炎患者多部位存在支原体感染,这可能与类风湿关节炎发病相关.
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肺炎衣原体PCR、套式PCR评价与临床应用
目的评价PCR和套式PCR检测肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae,Cpn)的特异性和灵敏度.方法按Campbell等建立PCR反应体系,按Tong等与秦玲等建立套式PCR反应体系,本文并以Cpn 16SrRNA基因(16SrDNA)为靶基因自行建立套式PCR反应体系,对Cpn、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、大肠埃希稀菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、粘质沙雷菌、洛菲不动杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜肺军团杆菌、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒进行检测以评价各方法的特殊性异性;以纯化的Cpn-DNA和1例阳性临床标本作梯度稀释后分别参与各反应体系检测以评价各方法的灵敏度.结果1、PCR和套式PCR均只能检出Cpn TW-183株和CWL-29株,而其它衣原体、支原体、细菌、病毒均不能检出;2、套式PCR检测Cpn较PCR敏感100～1000倍;3、经以16SrRNA基因为靶基因套式PCR检测新生儿肺炎(非吸入性肺炎)和儿童肺炎者咽拭子标本Cpn阳性率分别为16.2%和22.0%,肺结核者痰标本为18.9%,男性STD者尿道拭子标本为0%.结论PCR和套式PCR检测Cpn均有较高的特异性,其中套式PCR比PCR敏感100～1000倍,在肺部炎症者咽拭子或痰标本中Cpn有较高的检出率.
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肺炎支原体基因检测与分型方法的建立及初步应用研究
[目的]建立肺炎支原体PCR检测与分型鉴定方法,并应用于急性呼吸道感染患者肺炎支原体感染的检测及型别研究.[方法]设计肺炎支原体P1粘附因子基因特异性引物,采用套式PCR,对临床急性呼吸道感染患者的咽拭子标本进行肺炎支原体的检测与分型鉴定.[结果]应用肺炎支原体FH参考株建立快速、实用的PCR检测及分型鉴定方法,在临床标本儿童组中未检出肺炎支原体,成人组中检出1例,型别鉴定为P1-Ⅰ型.[结论]套式PCR技术对肺炎支原体检测与分型鉴定具有相对快速、简便、实用和特异性,值得在临床早期诊断及分子流行病学研究方面推广应用.
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一种检测胆螺杆菌套式 PCR 方法的建立
目的：建立一种敏感性高、特异性强的检测胆螺杆菌的套式PCR方法。方法基于17种胆螺杆菌亚种的16S rRNA 基因设计筛选出1套套式引物（2条内引物、2条外引物），优化反应条件后，通过模拟粪便标本、动物模型标本和临床标本的检测对方法的敏感性和特异性进行评估。结果模拟粪便标本中，该方法检测胆螺杆菌的敏感性达到10 CFU／100μL。3例感染胆螺杆菌的SPF级BALB／c小鼠模型中，3例小鼠粪便和盲肠中均可检测到胆螺杆菌，1例肝脏标本中检测到了胆螺杆菌。10例胆石病患者中，有2例患者的胆汁、胆囊粘膜和粪便标本中检测到了胆螺杆菌。结论本研究建立的套式 PCR方法，敏感性高、特异性强，可用于检测胆螺杆菌的感染。
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附红细胞体套式PCR方法的建立及其在交叉感染研究中的初步应用
目的 建立一种快速、准确检测附红细胞体的套式PCR方法,并在交叉感染研究中初步应用.方法 根据GenBank收录的猪附红细胞体16S rRNA基因序列为例,设计两对特异引物,建立套式PCR诊断方法.结果 所建立的套式PCR检测方法,具有极高的敏感性和特异性.结论 将猪附红细胞体人工感染小白鼠、家兔、犬及鸡,利用所建立的套式PCR进行检测,证明了猪附红细胞体在3种实验动物之间存在交叉感染.
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鹦鹉热衣原体套式PCR和DNA测序方法研究
目的建立特异、灵敏、快速的鹦鹉热衣原体(Cps)分子生物学检测方法.方法采用套式PCR扩增检测和DNA测序方法,并进行实验室评价.结果 4株Cps均能被套式PCR扩增出214bp目的条带,而沙眼衣原体、肺炎衣原体、肺炎支原体等其它微生物均不能检出;Cps套式PCR灵敏度高于Cps PCR;模拟样本均能被检出.Cps(CS株)套式PCR产物直接测序与Cps典型株序列完全一致.结论套式PCR是检测Cps特异、灵敏,且快速的分子生物学检测方法.
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套式PCR应用于恙虫病鼠类标本的检测研究
目的评价基因扩增法应用于检测鼠类标本调查恙虫病疫源地的作用。方法用一定量恙虫病东方体人工感染昆明种小鼠，攻击后第3、6、9天处死小鼠取血块及脾脏用特异性套式PCR技术进行恙虫病东方体DNA的检测，再用该技术测定现场采集的鼠类标本，以可从标本中扩增出一段长88bp的DNA片段作为实验或现场捕获鼠感染了恙虫病东方体的指标，继而估计该地区是否存在恙虫病疫源地。结果实验感染恙虫病东方体3天时在两类标本中均不能检出该病原DNA，而第6天测定时均可发现含有恙虫病东方体；从福建闽西北地区采集的111份鼠类脾脏中检出1份阳性标本，另从江西送检的29份野鼠血块中也检出1份阳性标本，说明采集标本区域已成为恙虫病疫源地。结论套式PCR扩增技术具有很好的特异性和敏感性，可用于现场鼠类标本的恙虫病病原学的调查。
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发酵支原体、穿通支原体双重套式PCR检测研究
目的应用双重套式PCR技术同时检测发酵支原体(Mf)和穿通支原体(Mpe)。方法以支原体16SvRNA基因为靶基因，外套引物为Mf与Mpe共用、内套引物则分别为Mf种特异和Mpe种特异，建立双重套式扩增体系。结果本双重套式PCR不仅能分别扩增Mf和Mpe的特异性DNA，并能同时扩增Mf和Mfe出现二条特征性条带，产物经测序证实。结论双重套式PCR是一种灵敏、特异和快速的Mf和Mpe检测方法。
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肺部炎性疾病者生殖支原体套式PCR检测研究
目的探讨生殖支原体(Mg)与肺部炎性疾病的关系.方法应用原核生物通用引物PCR直接测序克隆Mg 16SrRNA基因片段序列,自行建立Mg套式PCR扩增法,检测健康儿童和肺部炎性疾病患儿咽拭子标本中的Mg-DNA.结果健康儿童Mg阳性率为5%,儿童肺炎、儿童支气管炎、新生儿肺炎者阳性率分别为21.6%、28.6%、20%(P均＜0.01).结论 Mg可能与肺部炎性疾病相关联.
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牛源贾第虫套式PCR检测方法的建立
目的 建立牛源贾第虫套式PCR检测方法 .方法 根据牛源贾第虫TPI基因序列,设计1对保守引物和1对特异性引物,建立套式PCR检测方法 ;通过阳性参照摸索出该检测方法 的佳反应条件,进行特异性和敏感性试验;并用临床样品进行验证.结果 该套式PCR能特异性地扩增出牛源贾第虫基因组DNA中相应片段,与艾美耳球虫、隐孢子虫、环孢子虫、弓形虫、毛首线虫和纤毛虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应;低能检测到0.395 fg的阳性参照DNA.结论 建立的套式PCR方法 具有高度的特异性和敏感性,可以用于临床样品的检测.
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支原体感染与新生儿疾病关系的研究
目的研究支原体感染与新生儿疾病之间的关系.方法采用nPCR 对156例新生儿患儿及50例正常新生儿的咽拭子,进行解脲脲原体(Uu)、人型支原体(Mh)、生殖支原体(Mg)和发酵支原体(Mf)特异性核酸检测.结果 156例新生儿患儿中检出Mh,Mu,Mg和Mf的阳性率分别为84.6%,46.7%,1.92%,0%.(Uu+Mg)双重同时感染率为40.3%(63/156),(Uu+Mh+Mg)三重感染率为1.92%(3/156).50例正常新生儿仅1例检出Uu.结论同新生儿疾病支原体感染显著相关.
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应用套式PCR检测6种血清型钩端螺旋体
目的用套式 PCR 快速检测水沟和丛林等地的钩端螺旋体.方法选 Leptospira borgpetersenii 中的一段保守序列 IS1533,设计两对引物,用套式 PCR 检测六种不同血清型的钩体.结果 6株致病株均出现单一246bp 的特异性扩增产物,而腐生株、空白对照无任何 DNA 扩增条带.用琼脂糖凝胶电泳,能检测500fg 模板的扩增产物.结论套式 PCR 是一种灵敏度高、特异性强的快速检测自然疫源中钩体的有效方法.
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福建近年恙螨感染恙虫病东方体的检测研究
目的检测恙螨幼虫体内恙虫病东方体,分析福建恙虫病可能流行的趋势.方法从福建山区及沿海地区捕鼠采集恙螨幼虫,通过分类鉴定,以每只鼠体的寄生螨作为一个被检单位,用套式 PCR 扩增恙虫病东方体Sta 58kDa基因的88bp片段,以确定恙螨幼虫是否携带本病原,继而估计该地区是否存在恙虫病疫源地.结果从105份被检单位的恙螨幼虫检出7份恙虫病东方体阳性标本,主要宿主为黄毛鼠,主要媒介为纤恙螨属的地里纤及小板纤恙螨,与有关资料比较,证实本省恙虫病的宿主和媒介未发生明显变化.结论福建沿海地区恙螨的恙虫病东方体的感染率高于山区,疫源地有继续扩大的趋势.
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套式 PCR检测中国江苏省猪场猪鼻支原体和猪肺炎支原体的感染
目的：猪鼻支原体和猪肺炎支原体的感染在中国养猪业较为普遍，本研究对江苏省猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis ，Mhr）和猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae ，Mhp）流行病学进行初步调查。方法从江苏省不同的猪场采集7、14、21、28及35日龄仔猪的鼻拭子样本，用套式PCR方法对收集的399份鼻拭子样本进行M hr和M hp的检测。结果江苏省不同猪场样本中M hr的检出率为70．9％，M hp检出率为13．5％。5周龄以下的猪M hr的感染率要高于M hp。其中30个样本（7．5％）的检测结果为两种病原体共感染。7-35日龄的猪M hr的感染率随着日龄的增长呈现明显的上升趋势，但M hp的感染率并未随着仔猪日龄的增长而显著上升。从本研究结果分析还发现，不同品种的猪M hr的感染率存在显著差异，与其他品种猪相比姜曲海瘦肉型品种猪（Jiangquhai porcine lean strain ，JQHPL）更易于感染Mhr （p＜0．001），但是其Mhp的感染率与其他猪相比不存在显著性差异（P＞0．05）。结论本试验调查了江苏地区猪场中仔猪感染Mhr和Mhp的情况，且研究结果表明 M hr的感染状况与日龄及品种有一定关系。
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套式PCR及测序法检测痰中结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变
目的 应用套式PCR及测序法直接检测痰中结核分枝杆菌相关的embB基因突变,以期建立一种直接、快速、准确地检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的实验方法.方法 采用套式PCR扩增技术及测序法直接检测130例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌embB基因突变情况,同份痰标本同时做涂片抗酸染色、罗氏培养及菌型鉴定.结果 29例耐乙胺丁醇标本有18例发生基因突变,均为306位密码子突变,基因突变率为62.1%(18/29).结论 套式PCR及测序法可望成为一种快速、特异、准确地检测痰中结核分枝杆菌embB基因突变的好方法.
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套式PCR在检测结核分枝杆菌embB基因突变中的应用价值
目的 采用套式PCR(二次扩增)替代传统PCR(一次扩增)扩增痰中结核分枝杆菌embB基因,探讨其在检测结核分枝杆菌embB基因突变中的应用价值.方法 选取本院已确诊的活动性肺结核住院病人68例和非结核肺部感染病人16例,嘱其留取晨痰,分别进行套式PCR扩增和传统PCR扩增,再行产物分析.结果 68例活动性肺结核病人传统PCR扩增embB基因阳性结果为29例,阳性率为42.6%,套式PCR扩增embB基因阳性结果为47例,阳性率为69.1%,两者比较差异有显著性(χ2＝9.66,P＜0.05);16例非结核病人传统PCR和套式PCR和检测结果均为阴性,两者特异度均为100%.结论 检测结核分枝杆菌embB基因突变,套式PCR灵敏度高于传统PCR,两者特异度相同,套式PCR能快速、敏感、特异地扩增结核分枝杆菌embB基因片段.
