首页 > 文献资料
-
神经干细胞单细胞与神经球治疗大鼠脊髓损伤的对比研究
目的 比较神经干细胞(neural stem cells,NSCs)单细胞与神经球移植治疗大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的效果,研究两种NSCs移植方法治疗SCI的有效性.方法 取成年SD大鼠2只,体外分离脊髓组织并行NSCs培养,取第3代细胞行Hoechst33342、巢蛋白染色及贴壁分化鉴定.另取成年SD大鼠(体重230～250 g)60只,随机分为3组,每组20只,采用改良Allen法制备大鼠脊髓T10损伤模型.各组分别于SCI处缓慢注射5μL生理盐水(A组)、第3代NSCs单细胞(B组)、第3代NSCs神经球(C组).分别于术前及术后3、7、14、21、28 d采用BBB行为功能评定量表评定各组大鼠后肢功能;术后各时间点取材行HE染色和微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)免疫组织荧光染色观察.结果 经形态学观察及鉴定,所培养的细胞为NSCs.术后3d各组BBB评分较术前显著下降,术后3、7d各组间BBB评分比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；随时间延长BBB评分不同程度增加,术后14、21、28 d,B、C组BBB评分优于A组,C组优于B组,比较差异均有统计学意义(P＜0.05).HE染色示C组较A、B组脊髓结构清晰,瘢痕形成少.MAP-2免疫组织荧光染色示,术后3、7d各组间阳性细胞数比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；术后14、21、28 d,B、C组阳性细胞数显著多于A组,C组多于B组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 采用NSCs神经球移植较单细胞移植更明显促进NSCs向神经元分化,更有利于SCI后下肢功能恢复.
-
不同厚度神经球冰冻切片免疫荧光细胞化学染色结果的比较
目的 探索适合免疫荧光细胞化学染色的神经球佳冰冻切片厚度.方法 选取悬浮培养10～12 d的神经球,制作厚度分别为4、7、10μm的冰冻切片.采用免疫荧光细胞化学染色比较神经球神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达和定位.结果 培养10～12 d的神经球直径为200～ 250 μm,状态良好,折光性强,呈圆球状,周边有毛刺.4μm的神经球冰冻切片制作较难,容易卷片,但细胞层次清楚,染色均匀,密疏适宜,可较清楚计数细胞.成像清楚.胞核清晰,可见较多nestin染色阳性的完整胞质包绕4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色阳性的胞核,能观察更多的细胞间细节.7μm切片较4μm切片制作容易,切片较平整,细胞层次不如4μm切片清楚,染色较均匀.所含细胞数较4 μm多,可粗略计算细胞数.荧光拍照不能完全对焦,可见部分完整细胞形态.10 μm的冰冻切片制作相对容易,切片平整,但细胞层次不清楚,堆叠严重,成像不清楚,难以看到完整细胞形态.结论 4μm厚度的神经球冰冻切片较适合进行免疫荧光细胞化学染色和分析.
关键词： 神经球 冰冻切片 厚度 悬浮培养 神经上皮干细胞蛋白(nestin) -
咪康唑与纤维蛋白协同促进神经球分化为成髓鞘样细胞
目的:探讨咪康唑与纤维蛋白能否协同促进神经球分化为成髓鞘样细胞.方法:培养并鉴定胎鼠神经球;通过MTr法确定不同浓度咪康唑对神经球存活的影响;将神经球按培养条件不同分为四组,对照组、咪康唑组(mico组)、纤维蛋白组(fibrin组)及纤维蛋白-咪康唑联用组(fibrin+ mico组),培养两周后以免疫荧光染色比较髓磷脂碱性蛋白(MBP)的表达;Western Blot法比较MBP、2'3’环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)、整合素、细胞外调节蛋白激酶及其磷酸化(ERK、p-ERK)的表达.结果:(1)神经球阳性表达巢蛋白(nestin)和CD133:当咪康唑浓度低于或等于1.5 μmol/L时,神经球存活在各组之间不存在统计学差异(P＞0.05),但2.5 μmol/L组显著低于2 μmol/L组和1.5μmol/L组(P＜0.05).(2)免疫荧光结果显示:神经球分化所成的成髓鞘样细胞表达MBP阳性,呈多突起形态;fibrin组及mico组MBP相对荧光强度均高于对照组(P＜0.05),fibrin+ mico组神经球分化为网络状的成髓鞘样细胞团,其相对荧光强度高于其他组(P＜0.05).(3) Western Blot结果显示:fibrin+ mico组MBP及CNPase表达显著高于mico组和fibrin组(P＜0.05),fibrin+ mico组整合素表达及p-ERK/ERK显著高于mico组和fibrin组(P＜0.05),同时咪康唑及纤维蛋白对MBP、CNPase、整合素的表达及p-ERK/ERK的效应具有交互作用(P＜0.05).结论:咪康唑与纤维蛋白能协同促进神经球分化为成髓鞘样细胞,其机制可能与ERK磷酸化有关.
-
大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞的分离和培养
目的:体外培养大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞(NSCs),观察其生长及诱导分化培养特点.方法:取孕12.5～14.5 d的SD大鼠,采用机械分离法获取中脑腹侧组织,剪碎并吹打成单细胞悬液后,以2×105个细胞/ml的密度接种到无血清NSCs培养基中以神经球法培养.培养神经球5～7d后,按原密度进行传代培养,并取第三代培养的神经球用含10％胎牛血清(FBS)分化培养液分化培养,分化培养7d后行免疫细胞化学鉴定.结果:神经球呈巢蛋白(nestin)阳性,诱导分化后的细胞作分别呈微管蛋白(βⅢ-Tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性.结论:经神经球法培养得到的大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞可自我增值,并可诱导分化成神经元和胶质细胞.
-
体外培养中脑神经干细胞的生物学特性鉴定及分化后TH、DJ-1和Nurr1的表达
目的:应用体外细胞培养技术,探讨腹侧中脑神经干细胞的生物学特性及分化后TH、DJ-1和Nurr1的表达情况.方法:体外分离培养新生0～1 d C57BL/6仔鼠腹侧中脑神经干细胞,应用倒置相差显微镜观察中脑神经干细胞的生长状况;通过BrdU掺入实验明确神经干细胞的增殖情况;利用免疫荧光细胞染色法观察子代细胞分化趋势和DA分化相关因子TH、D J-1和Nurr1的阳性表达情况.结果:在条件培养基的作用下,腹侧中脑神经干细胞呈悬浮的神经球生长,增殖速度较慢,干细胞数量较少;低血清自然分化条件下,中脑神经干细胞更易分化为Tuj-1阳性神经元,且分化为TH阳性神经元的数量增加;DJ-1和Nurr1呈上升趋势,且具有时间依赖性,d7与d3组比较,有显著差异(P＜0.05).结论:结果表明腹侧中脑神经干细胞在增殖和分化方面存在区域特异性,提示腹侧中脑神经干细胞特殊的生物学特性.此研究可为干细胞移植治疗帕金森病的优势供体选择提供有利的探索和理论依据.
-
成年小鼠神经干细胞体外培养、鉴定及分化
目的:建立一种简便易行的从成年小鼠脑组织分离、培养和鉴定神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法,为相关研究提供新的研究手段.方法:采用机械分离和酶消化结合方法分离成年昆明种小鼠的脑组织,用无血清培养基悬浮培养;倒置相差显微镜观察细胞形态;MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)观察NSCs的自我增殖能力;免疫荧光细胞化学技术检测NSCs标志物巢蛋白(Nestin)的表达;多聚赖氨酸铺板和撤除培养基中FGF和EGF的条件下,给予5%血清和1 μm维甲酸诱导NSCs分化,免疫荧光细胞化学技术检测GFAP(标记胶质细胞),β-tubulin Ⅲ(标记神经元)蛋白的表达来测定NSCs的分化能力.结果:从成年小鼠脑组织分离的细胞,在无血清培养液中可形成神经球,并可在体外扩增和连续传代,免疫荧光细胞化学表明神经球Nestin阳性表达,在给予血清和维甲酸条件下神经球可表达GFAP和β-tubulin Ⅲ.结论:本研究成功建立了体外培养成年小鼠脑组织分离和培养NSCs的方法,培养的NSCs具有自我更新、增殖及多向分化潜能.此方法是一个稳定、简便易行的方法,可广泛用于神经干细胞相关的基础和应用研究.
-
大鼠受损视神经中神经前体细胞的变化及预变性腓总神经的调节
为了研究大鼠受损视神经内神经前体细胞的变化及调节,本研究建立了成年雄性大鼠视神经损伤及自体腓总神经移植模型,分正常组、损伤组和移植组,体外培养视神经的神经前体细胞,在相差显微镜下观测各组神经前体细胞神经球的形态和数目,以免疫荧光细胞化学方法对神经球细胞进行鉴定.结果显示:正常组神经球较小、较少,多数细胞表达nestin、GFAP或半乳糖脑苷脂(GC);视神经损伤后神经球的总数有所增加,但大神经球数明显减少,nestin、GFAP或GC阳性细胞也明显减少;神经移植后增加了各类神经球数,nestin、GFAP或GC阳性细胞也明显增加.本研究提示成年大鼠视神经内神经前体细胞较少,增殖能力较弱;视神经损伤也伤及其神经前体细胞并抑制其增殖;自体神经移植能保护神经前体细胞并促进其增殖.
-
体外培养的神经球中表达神经巢蛋白细胞的流式细胞术检测
采用体外培养不同时间的神经干细胞球,间接荧光法标记神经巢蛋白(nestin),以流式细胞术检测神经干细胞球中表达nestin细胞的情况.结果显示:在培养不同时间的细胞群体中均检出nestin阳性细胞,培养7 d、1月、3月和6月的细胞群含nestm阳性细胞数百分比分别为(42.2±7.6)%、(41.7±7.3)%、(33.8±12.9)%和(37.1±5.0)%,几个时间点的细胞群体所含的nestin阳性细胞数的百分比之间无显著性差异.提示,在体外培养条件下,神经干细胞群体可能通过自我更新和分化的调控,保持nestin阳性细胞于一种较为恒定的比例.
