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人增生性瘢痕组织中微血管内皮细胞的分离、纯化和培养
目的微血管内皮细胞(MEC)增殖和血管发生存在于很多生理和病理过程中,为体外重建人增生性瘢痕组织微血管内皮细胞(HSMEC)生长模型. 方法正常人包皮和增生性瘢痕经1.25 g.L-1 dispase和1.25 g.L-1胰蛋白酶依次消化4℃ 24 h后,机械挤压分离组织内HSMEC和人真皮微血管内皮细胞(HDMEC),经5000 U.L-1 bFGF, 200 mL.L-1胎牛血清的DMEM内培养和0.1 g.L-1胰蛋白酶, 0.15 mmol.L-1 EDTA的TE分离、纯化,组织学HE染色和Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色,观察MEC的阳性细胞百分数. 结果 MEC在含bFGF培养基中增殖旺盛,少量混生的成纤维细胞经TE分离MEC而被基本遗弃, 3代MEC能获得97.0%～98.0%的纯度,明显高于原代培养(P<0.01),HSMEC形态学与HDMEC无明显差异. 结论低浓度bFGF和TE细胞分离液分别对MEC的培养和纯化有可靠作用, HSMEC的培养成功为烧伤创面愈合和瘢痕增生机制的研究扩展了空间.
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血管生成机制的研究进展
血管生成(agiogenesis)是指在机体生长发育过程中或创伤修复、缺血缺氧和炎症等情况下,原有微血管内皮细胞(endothelial cell, EC)经过生芽、迁移、增殖与基质重塑等形成新毛细血管的过程[1].包括五个阶段:(1)血管细胞分泌蛋白水解酶降解血管基底膜;(2)EC穿过基底膜迁移到血管周围基质;(3)EC增殖、相互黏附并连接;(4)形成管腔样结构;(5)基质重塑和平滑肌细胞的包绕及血管的相互吻合形成血管网.血管生成与创伤修复、缺血性疾病、肿瘤、妇科和内分泌等多种疾病或病理过程的发生、发展和预后密切相关.
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人增生性瘢痕中整合素连接激酶表达及与血管生成的关系
目的 探讨不同生长期人类瘢痕中整合素连接激酶(ILK)表达及与血管生成的关系.方法 (1)将笔者单位2009年12月-2010年12月收治的15例烧伤瘢痕患者按瘢痕生长时间分为:小于6个月组、6～12个月组、大于12个月组,每组5例.采集各组瘢痕组织,用免疫组织化学法观察ILK的表达分布,实时荧光定量RT-PCR法检测ILK mRNA的表达水平.(2)取小于6个月组瘢痕组织,分离培养瘢痕微血管内皮细胞(MEC),免疫磁珠法纯化后用花青类荧光染料Cy3标记的凝血因子Ⅷ进行鉴定,以人皮肤Fb为对照.取对数生长期MEC,按随机数字表法分为3组:对照组,仅用含微血管生长添加剂的M131培养液培养；空质粒组,用空载质粒转染；ILK互补DNA转染组,用ILK互补DNA表达质粒转染.转染24h后,实时荧光定量RT-PCR法检测各组细胞中ILK、激酶功能区受体(KD R)、fms样酪氨酸激酶1(Flt1)的mRNA表达情况.对数据进行单因素方差分析. 结果 (1)小于6个月组瘢痕组织表皮基底细胞、MEC及Fb胞质中均有ILK阳性表达,6～12个月组瘢痕组织中仅表皮基底细胞可见ILK阳性表达,大于12个月组瘢痕组织中ILK阳性表达不明显.(2)小于6个月组瘢痕组织中ILK mRNA表达水平(0.34±0.16)明显高于6～12个月组(0.17±0.06)及大于12个月组(0.07±0.13),F=37.007,P - 0.000.(3)纯化后MEC呈铺路石样密集生长,胞质中凝血因子Ⅷ呈阳性表达；人皮肤Fb中未见凝血因子Ⅷ表达.(4)ILK互补DNA转染组瘢痕MEC中ILK、KDR及Flt-1的mRNA表达水平分别为57.807±5.556、0.836±0.014、0.162±0.005,均显著高于对照组的0.018±0.003、0.028±0.020、0.023±0.004和空质粒组的0.042±0.005、0.039±0.0070.046±0.003(F值分别为87.110、11.241、18.199,P值均小于0.01).结论 ILK主要表达于小于6个月的早期瘢痕组织中,并可以通过调节瘢痕MEC中的KDR及Flt-1 mRNA表达来影响早期瘢痕的血管生成,在早期瘢痕增生过程中具有重要作用.
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活性氧对烧伤大鼠血清诱导肺微血管内皮细胞凋亡的影响
目的 观察大鼠严重烧伤后及肺微血管内皮细胞(PMVEC)经烧伤血清刺激后活性氧水平,探讨活性氧与PMVEC凋亡的关系. 方法 (1)取24只SD大鼠按随机数字表法(分组方法下同)分为假伤组3只、烧伤组21只,烧伤组大鼠背部造成30％ TBSAⅢ度烫伤,假伤组大鼠致假伤.伤后6、12、24、36、48、60、72 h按随机数字表法分别取3只烧伤组大鼠,腹主动脉取血,ELISA法检测血清中活性氧含量;假伤组大鼠行相同检测.(2)取5只SD大鼠按前述方法造成烫伤,伤后24 h制备烧伤大鼠血清;另取5只SD大鼠不作处理,制备健康大鼠血清.(3)切取20只SD大鼠幼鼠肺外边缘组织,组织块法培养细胞,免疫组织化学法鉴定细胞.取第3代对数生长期PMVEC分别接种于6孔板和12孔板,均分为4组(每组设3个复孔):正常血清组、烧伤血清组,无血清内皮细胞专用培养液中分别加入体积分数15％健康大鼠血清、体积分数15％烧伤大鼠血清培养;正常血清+锰四(4-苯甲酸)卟啉(MnTBAP)组、烧伤血清+MnTBAP组,在前2组的基础上再分别加入100 μmol/L MnTBAP培养.培养24 h后,流式细胞仪检测6孔板中细胞内活性氧含量,吖啶橙-溴化乙啶染色观察12孔板中细胞凋亡情况并计算凋亡率.对数据行单因素方差分析、LSD-t检验. 结果 (1)烧伤组大鼠伤后24、36、48、60、72 h血清中活性氧含量分别为(187 ±21)、(235 ±22)、(231 ±25)、(291 ±20)、(315±23) nmol/mL,显著高于假伤组的(141±19) nmol/mL(t值分别为7.86、9.57、13.87、14.98、18.40,P值均小于0.01).(2)原代培养细胞生长较慢,呈铺路石样生长;传代后细胞呈均匀分布生长.细胞凝血因子Ⅷ阳性表达率为(96±5)％,鉴定为PMVEC.(3)培养24 h后,正常血清组、烧伤血清组、正常血清+ MnTBAP组、烧伤血清+MnTBAP组PMVEC中活性氧含量分别为798±40、1 294±84、763±59、926 ±42(F=93.01,P＜0.01),细胞凋亡率分别为(6.2±1.3)％、(57.3±6.7)％、(3.7±0.8)％、(28.7±5.7)％(F=224.50,P＜0.01).与正常血清组比较,烧伤血清组PMVEC中活性氧含量、细胞凋亡率明显增加(t值分别为10.40、49.06,P值均小于0.01);烧伤血清+MnTBAP组PMVEC中活性氧含量、细胞凋亡率较烧伤血清组明显减少(t值分别为7.48、23.94,P值均小于0.01). 结论 大鼠严重烧伤后血清中活性氧上升,烧伤大鼠血清刺激PMVEC可以导致细胞内活性氧以及细胞凋亡增加,应用MnTBAP清除活性氧可减少烧伤大鼠血清诱导的细胞凋亡.
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短暂高糖环境暴露对人真皮微血管内皮细胞生物学行为的影响
目的 观察短暂高糖环境暴露对体外培养人真皮微血管内皮细胞生物学行为的影响.方法 本研究所有检测指标对应的细胞分组及处理如下:将第4代人真皮微血管内皮细胞按随机数字表法分成3组,每组12孔.对照组细胞采用含5 mmol/L D-葡萄糖的完全培养液培养7d;短暂高糖组细胞在含30 mmol/L D-葡萄糖的完全培养液中培养2d,再改用含5 mmol/L D-葡萄糖的完全培养液继续培养5d;长时高糖组细胞采用含30 mmol/L D-葡萄糖的完全培养液培养7d.(1)采用倒置光学显微镜观察对照组和长时高糖组培养7d以及短暂高糖组培养2、7d细胞形态学变化.(2)培养0、2、4、7d,采用细胞存活率分析计数器检测细胞增殖率.(3)培养2d后进行划痕实验,划痕后继续培养,于划痕后0、24、48、72、96、120 h测量划痕面积,计算后5个时相点细胞迁移率.(4)培养0、2、4、7d,采用细胞分析仪检测细胞凋亡率.(5)培养7d后再在基质胶上培养24 h,采用倒置光学显微镜观察血管样结构形成情况,并计算血管样结构长度、分叉点数量.(6)培养2、4、7d,采用实时荧光定量RT-PCR法检测血管化相关基因基质金属蛋白酶组织抑制剂3(TIMP-3)mRNA表达.对数据行析因设计方差分析、重复测量方差分析、单因素方差分析、LSD检验. 结果 (1)对照组细胞培养7d,细胞呈卵圆形,铺路石样排列.短暂高糖组细胞培养2d,形态变细长,排列丧失铺路石样;培养7d仍保持细长,丧失铺路石样排列.长时高糖组细胞培养7d,形态变细长,排列丧失铺路石样.(2)培养0d,3组细胞增殖率差异无统计学意义(F=0.23,P＞0.05).培养2d,短暂高糖组和长时高糖组细胞增殖率相近(P＞0.05),且均低于对照组(P值均小于0.01);培养4、7d,短暂高糖组和对照组细胞增殖率相近(P值均大于0.05),且均高于长时高糖组(P值均小于0.01).(3)划痕后24～ 120 h,短暂高糖组和长时高糖组细胞迁移率均相近(P值均大于0.05),且均低于对照组(P值均小于0.01).(4)培养0d,3组细胞凋亡率差异无统计学意义(F=0.78,P＞0.05).培养2d,短暂高糖组和长时高糖组细胞凋亡率相近(P＞0.05),且均高于对照组(P值均小于0.01);培养4、7d,短暂高糖组和对照组细胞凋亡率相近(P值均大于0.05),且均低于长时高糖组(P值均小于0.01).(5)短暂高糖组和长时高糖组细胞形成血管样结构长度分别为(1.84±0.10) ×105、(1.82±0.11) ×105 μm(P＞0.05),均短于对照组的(2.75±0.23) ×105 μm(P值均小于0.01);短暂高糖组和长时高糖组细胞形成血管样结构分叉点数量分别为(43±5)、(46 ±8)个(P＞0.05),均少于对照组的(103 ±21)个(P值均小于0.01).(6)培养2、4、7d,短暂高糖组和长时高糖组细胞TIMP-3的mRNA表达量相近(P值均大于0.05),且均低于对照组(P值均小于0.05). 结论 短暂高糖环境暴露能诱导体外培养的人真皮微血管内皮细胞形态、迁移和血管形成发生“代谢记忆”从而导致其产生持久的生物学行为变化,其机制可能与调控血管化相关基因发生改变有关.
