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大鼠脑皮质微血管内皮细胞的培养
目的:培养脑皮质微血管内皮细胞.方法:取1-5d Wistar乳鼠脑皮质,经不同孔径的筛网过滤后,用胶原酶振荡消化获得的微血管内皮细胞进行培养,用Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定.结果:培养的细胞呈单层贴壁生长,7～9d呈典型的铺路卵石样征象.结论:建立了一种简便易行的培养脑皮质微血管内皮细胞的方法.
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人胎盘微血管内皮细胞体外原代培养及鉴定方法
目的探索人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法,并对其进行鉴定,为构建体外人胎盘屏障极性模型奠定基础.方法采用酶消化法,获取组织及细胞悬液,经密度梯度离心后,获得较高产量微血管内皮细胞,并进行体外培养.进一步对人胎盘微血管内皮细胞进行免疫细胞化学法的Ⅷ因子相关抗原及CD34鉴定,用透射电镜观察细胞质Weibel-Palade小体.结果体外培养出纯度较高的微血管内皮细胞并培养了3～5代.此外,免疫组化显示Ⅷ因子相关抗原及CD34表达阳性,电镜下观察到Weibel-Palade小体.结论成功分离并培养人胎盘微血管内皮细胞.
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大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养
目的 建立稳定的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)体外培养模型,并对其生物学特性进行初步研究.方法 取Sprague-Dawley大鼠脑组织,通过匀浆、酶消化和梯度离心获得纯化的脑微血管段后,接种于涂布明胶的培养瓶进行原代培养;培养的细胞采用相差显微镜形态学观察、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定;采用跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance, TEER)检测单层细胞通透性;Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法测定细胞生长曲线.结果 细胞从贴壁的脑微血管段周围长出,呈短梭形和多角形,区域性单层生长,5～7 d细胞融合,经Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学检测证实培养的细胞是血管内皮细胞,原代培养的脑微血管内皮细胞表现出很强的屏障特性,随着传代次数的增加脑微血管内皮细胞的跨内皮阻抗减弱.结论 提示该方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养,原代培养的脑微血管内皮细胞是研究脑部微血管和血脑屏障的可靠技术手段.
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大鼠肺微血管内皮细胞的G蛋白亚型鉴定
本实验拟在体外培养大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVECs)的基础上，用免疫细胞化学S-P法和免疫荧光细胞化学间接法检测RPMVECs膜G蛋白亚型。1 材料和方法1.1 材料 DMEM培养干粉(美国GIBICO公司)；荧光（FITC）结合的羊抗兔抗体、兔抗大鼠IgG抗体免疫血清(北京中山公司)；Gsα、Giα和Gqα兔抗大鼠抗体（IgG）(Santa Cruz Biotechnology.Inc)。
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烧冲复合伤早期肺微血管内皮细胞与PMN粘附的变化
烧冲复合伤早期肺微血管通透性损伤与肺内白细胞尤其是多形核白细胞(PMN)的聚集有关,而此时肺ICAM-1、外周血PMN的CD11b表达明显上调并与PMN在肺内聚集有关[1].
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TNF-α对大鼠肺微血管内皮细胞β-受体及其相关GRKs的影响
目的探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肺微血管内皮细胞(PMVEC)β-受体(β-AR)和β-AR 相关的G蛋白偶联受体激酶(GRKs)的影响及山莨菪碱的干预作用.方法采用放射性配基结合法观察TNF-α作用后大鼠PMVEC β-AR大结合容量Bmax的变化;采用Western blot观察与β-AR相关的GRKs在蛋白水平的表达及TNF-α的影响.结果大鼠 PMVEC β-AR的大结合容量Bmax为(5.58±0.31)fmol/105细胞;TNF-α组β-AR的Bmax显著低于对照组,TNF-α+山莨菪碱组β-AR的Bmax与对照组比较无显著差异;大鼠 PMVEC GRK2蛋白表达为阳性,但GRK3、GRK5和GRK6表达为阴性;TNF-α组和TNF-α+山莨菪碱组GRK2蛋白表达较正常对照组显著增高.结论大鼠PMVEC表达GRK2,但不表达GRK3、GRK5和GRK6;TNF-α诱导的GRK2表达增高可促进β-AR的磷酸化,从而促进β-AR与G蛋白失偶联和β-AR的内化,这可能是TNF-α致大鼠PMVEC β-AR下调的主要机制;山莨菪碱不是通过抑制GRK2表达增加,而是通过其它机制抑制TNF-α引起的β-AR下调.
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微血管内皮细胞对小鼠造血干细胞增殖的影响
目的 探索微血管内皮细胞(MECs)对造血干细胞(HSCs)增殖的影响,以建立一种促进HSCs增殖的方法.方法 选取C57BL/6小鼠和C57系GFP小鼠,处死获取肺叶组织.(1)MECs的分离、培养和鉴定:肺组织经Ⅰ型胶原酶消化获得的细胞在含20％胎牛血清(FBS)、2 ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)、100U/mL肝素、0.1 mg/mL青霉素及链霉素的DMEM-F12培养基培养,第8天进行CD31荧光鉴定,“铺路石”细胞用于共培养并以流式细胞仪(FCM)检测八因子相关抗原(vWF)、CD31、CD34、CD45表达率.(2)GFP小鼠HSCs的分离、鉴定:密度梯度离心法和MACs-CD117+磁珠法分选HSCs,FCM检测纯度及CD117 CD34共表达率.(3)MECs促HSCs增殖:设立对照组(HSCs)、共培养组(MECs+ HSCs),培养7d,观察HSCs生长情况并计数、计算扩增倍数;第7天,收集共培养组HSCs,FCM检测CD117 CD34共表达率.结果 (1)肺MECs:第3天形成细胞簇,第6天成“血管样”改变,第14天为“铺路石”外观.培养第8天CD31阳性率为54.5％.vWF、CD31、CD34、CD45阳性率分别为81.39％、45.80％、57.48％、0.17％.(2)平均每只小鼠骨髓经MACs分选后可获约4.7×105个CD117+细胞,纯度为99.51％.(3)随着培养时间的延长,两组HSCs计数均有所增加,但共培养组HSCs扩增倍数大于对照组(P＜0.05).第1～7天共培养组与对照组细胞数相对变化倍数分别为1.21、1.35、1.50、1.72、1.71、1.75和1.78(P＜0.05),第4天变化明显.共培养7d后HSCs的CD117 CD34共表达率为92.06％.结论 MECs对HSCs增殖有促进作用,共培养第4天促进作用明显,并且MECs可以促进HSCs CD34的表达.
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间质细胞在牵张刺激心肌细胞肥大中的作用
大量研究表明心脏是一个重要的内分泌器官。心肌间质细胞(主要是成纤维细胞、微血管内皮细胞)约占心肌组织细胞总数的40%，但是，单独针对心肌组织中各种间质细胞功能的离体研究较少。尤其是对于成纤维细胞、微血管内皮细胞在受到超负荷力学机械刺激后的内分泌功能有何变化及其在超负荷心肌肥大机制中的作用均不清楚。 我们应用体外细胞牵张刺激模型，采用条件培养基刺激法观察成纤维细胞、微血管内皮细胞在受到牵张刺激后的内分泌活化情况及在心肌细胞肥大中的作用。结果发现，对培养在硅酮膜上的成纤维细胞和微血管内皮细胞进行20%牵张刺激，24h即可见到两种细胞培养上清中血管紧张素Ⅱ和内皮素含量显著升高，牵张时间延长，二者的浓度进一步显著增加。因此，上述结果不仅说明牵张刺激可诱导成纤维细胞、微血管内皮细胞的内分泌活化，还提示牵张刺激对内分泌的活化作用具有时间依赖性。另外，我们发现牵张刺激成纤维细胞、微血管内皮细胞的条件培养基均可显著刺激心肌细胞3H-Leu掺入、c-fos蛋白及β-MHC mRNA的表达，提示牵张刺激可通过诱导心肌间质细胞内分泌活化启动心肌细胞肥大反应。血管紧张素Ⅱ、内皮素受体拮抗剂可明显抑制心肌细胞3H-Leu掺入率、c-fos蛋白及β-MHC mRNA的表达。但是，当联合应用上述两种受体拮抗剂时，3H-Leu掺入率、c-fos蛋白及β-MHC mRNA表达的抑制率可达80%以上，但并不能完全抑制，说明牵张刺激可诱导成纤维细胞和内皮细胞分泌包括血管紧张素Ⅱ和内皮素等在内的多种细胞因子、生长因子参与刺激心肌肥大反应，如成纤维细胞生长因子、转化生长因子等。因此，研究表明预防或逆转超负荷心肌肥大的佳措施可能仍然是减轻心肌组织受到的过度应力刺激。
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骨髓微血管内皮生物学特性与造血调控
骨髓微血管内皮细胞是构成骨髓造血微环境的重要细胞成份,通过分泌胞外基质,细胞生长因子以及与造血细胞的直接接触,成为决定造血细胞归巢定位和增殖分化的重要因素.本文就其起源,分离培养,粘附分子表达,细胞因子分泌,以及与造血细胞归巢、造血调控的关系进行综述.
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天然水蛭素对人微血管再生作用的初步研究
目的 研究天然水蛭素对人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cells,HMVECs)增殖的影响及其诱导血管再生的机制.方法 取HMVECs接种至Matrigel基质胶培养24 h,体外建立三维培养模型,于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况.然后将细胞三维培养模型随机分为不同浓度天然水蛭素培养组(1、4、7 ATU/mL组)以及单纯含10％FBS的DMEM培养基培养组(对照组).各组细胞三维培养模型加入对应培养基后,培养24、48、72h采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞增殖情况;培养24h行成管实验并采用免疫荧光染色法测定细胞VEGF及Notch1表达水平.结果 细胞三维培养观察示,HMVECs于基质胶上贴附良好,24 h时完全形成管腔样结构.CCK-8检测示,各时间点1、4 ATU/mL组A值均高于对照组(P＜0.05),其中4ATU/mL组高;而7 ATU/mL组A值显著低于对照组以及1、4ATU/mL组(P＜0.05).细胞成管实验示,1、4 ATU/mL组成管数量较对照组及7ATU/mL组明显增多,且4ATU/mL组多于1ATU/mL组,差异有统计学意义(P＜0.05);7ATU/mL组与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).免疫荧光染色示,与对照组比较,1、4 ATU/mL组Notch1表达量增高,7 ATU/mL组降低;其中4、7ATU/mL组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).1、4、7 ATU/mL组VEGF表达量均较对照组增高,4 ATU/mL组高于1、7 ATU/mL组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 低、中浓度天然水蛭素可促进HMVECs增殖使血管再生,高浓度天然水蛭素则对HMVECs增殖及血管再生起抑制作用;其作用机制可能与VEGF-Notch信号通路有关.
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人胎盘组织液在小鼠脑微血管内皮细胞增殖中的作用研究
目的:研究人胎盘组织液对小鼠脑微血管内皮细胞增殖的影响.方法:采用细胞计数和MTT法观察不同稀释度人胎盘组织液作用72 h后,小鼠脑微血管内皮细胞增殖情况.同时以免疫组织化学法检测不同稀释度人胎盘组织液对小鼠脑微血管内皮细胞增殖细胞核抗原表达的影响.结果:一定稀释度的人胎盘组织液可促进小鼠脑微血管内皮细胞的增殖,25 ml/L即可发挥作用,200ml/L作用明显.小鼠脑微血管内皮细胞PCNA表达阳性率与人胎盘组织液稀释度呈剂量相关性.结论:人胎盘组织液可促进体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞增殖.
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小鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养
目的 建立小鼠心肌微血管内皮细胞培养体系.方法 4～6周的清洁级C57小鼠的心室肌,利用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶消化过滤收集的滤液进行重新悬浮种植于明胶包被的培养瓶中,通过倒置电镜观察细胞的生长形态及生长状态,得出生长曲线,并利用免疫荧光鉴定(心肌微血管内皮细胞特异性抗原vWF)培养出的小鼠心肌微血管内皮细胞.结果 通过形态学观察及免疫荧光鉴定证实为小鼠心肌微血管内皮细胞.培养的小鼠心肌微血管内皮细胞第1、2天生长相对缓慢,而到第3、4天细胞呈对数生长,第6、7天细胞达到融合.结论 采用明胶包被培养瓶,通过机械剪切、蛋白酶消化、过滤方法,并进行了相关鉴定,可获得较纯的小鼠心肌微血管内皮细胞,这为研究心肌微血管内皮细胞的迁移、血管再生等提供了实验来源.
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人卵巢癌微血管内皮细胞的培养与鉴定
目的 建立人卵巢癌微血管内皮细胞(ovarian carcinoma-derived microvascular endothelial cells,ODMECs)体外培养体系.方法 采用胶原酶、胰酶联合消化法分离微血管内皮,经percoll梯度密度离心纯化.光镜、电镜、流式细胞术、免疫细胞化学对所获得的ODMECs进行鉴定.结果 所获ODMECs流式分析有内皮标志物CD34/VEGF-R2表达;免疫荧光FⅦ-RAg阳性;电镜下见细胞多核、有丰富的微丝、Weibel-Palade小体等;培养中的内皮细胞生长状态良好、呈现典型的铺路石征,可传代培养.结论 本研究建立了人ODMECs体外培养体系,对了解卵巢癌血管内皮的异质性有重要价值,为抗卵巢癌血管生成的研究奠定了基础.
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选择性培养的牛视网膜微血管内皮细胞VEGF的表达(摘要)
目的建立牛视网膜微血管内皮细胞选择性分离培养的简便经济方法,并检验视网膜微血管内皮细胞合成分泌的VEGF.
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成年大鼠心脏微血管内皮细胞的原代培养及鉴定
血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VEC)是血液和血管平滑肌间的机械屏障,与机体物质转运、凝血、免疫和生物活性物质释放等多种生命活动密切相关,是重要的代谢和内分泌器官之一[1-2].VEC通过多种体液因子的生成和分泌,在调整局部血液动力学和血管细胞黏附方面起到至关重要的作用[3-5].VEC是组织细胞培养对象之一,被广泛应用于心血管疾病、肿瘤血管生成和血管修复等领域研究.大血管如主动脉内皮细胞主要是作为血管内衬,保证血液流动通畅,而毛细血管除完成通透功能外,尚有再生血管能力,微血管内皮细胞具有显著的组织器官异质性[6-8],故不同来源的VEC应用价值及潜在意义不同.
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阿司匹林对心肌微血管内皮细胞血管新生功能的影响
目的:探讨不同剂量阿司匹林对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)血管新生功能的影响和可能的机制.方法:消化法分离大鼠CMECs,用不同浓度(1、10、100、1 000和5 000 μmol/L)的阿司匹林处理体外培养的大鼠CMECs后,分别用CCK-8比色法检测细胞增殖、TUNEL法检测细胞凋亡、划痕试验及Transwell小室评价细胞迁移能力、成管实验评价血管新生能力、Western blot法检测蛋白激酶B(AKT)磷酸化水平,ELISA法测定纤维连接蛋白(FN)表达.结果:①1、10和100 μmol/L的阿司匹林对,CMECs的增殖、凋亡和AKT磷酸化水平无明显影响,1 000、5 000 μmol/L的阿司匹林对组显著抑制CMECs增殖、下调AKT磷酸化水平、诱导细胞凋亡;②10、100 μmol/L的阿司匹林促进CMECs迁移、成管;③FN表达随阿司匹林浓度升高而升高.结论:①低浓度阿司匹林(1～100 μmol/L)对CMECs的存活无明显影响,而高浓度的阿司匹林(1 000、5 000 μmol/L)显著抑制CMECs增殖、下调AKT磷酸化水平、细胞凋亡增多.②低浓度阿司匹林(1～100 μmol/L)作用下,阿司匹林促进CMECs迁移、成管能力,可能与阿司匹林作为环氧化酶(COX)抑制剂,减少前列环素(PGI2)生成引起FN表达上调有关.
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Müller细胞对大鼠视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响
目的:用免疫磁珠法原代培养大鼠视网膜微血管内皮细胞(RMEC),观察共培养Müler细胞对视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响.方法:采用免疫磁珠的细胞分选法分离大鼠视网膜微血管内皮细胞,在条件培养基中培养生长,采用第Ⅷ因子抗体免疫组化染色方法鉴定细胞,采用流式细胞术和台盼兰染色分析传代中的微血管内皮细胞纯度以及细胞活性.传统的方法培养并鉴定Müler细胞.采用不同孔径微孔滤膜培养小室,进行大鼠视网膜微血管内皮细胞与Müler细胞分离共培养,对照组培养环境中无Müler细胞.以细胞曲线描绘反映细胞增生,并用流式细胞仪测定细胞周期.相差显微镜下计算穿过微孔滤膜迁移贴附于背面的内皮细胞数量.结果:通过磁珠分离方法获得了纯度为97.13%大鼠视网膜微血管内皮细胞,细胞活力达92%,第Ⅷ因子抗体染色呈阳性.与Müler细胞共培养的RMEC可早于正常培养2～3d进入生长平台期.RMEC中S期和G2期比例增加,G1期比例相对减少.S、G2和G1期百分比,在共培养组24h分别为44.0%,11.2%和44.8%,48h分别为42.3%,10.9%和46.8%;对照培养组24h分别为41.3%,4.9%和53.8%,48h分别为40.1%,4.7%和55.2%.迁移的细胞数增加,共培养6h移行至膜下的内皮细胞数12.2±2.5个,12h为51.7±23.4个,对照培养6h移行至膜下的内皮细胞3.3±2.5个,12h为14.7±7.0个,6h和12h两组内皮细胞数差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:免疫磁珠细胞分选方法可以获得高纯度的大鼠视网膜微血管内皮细胞,且对细胞活力无影响.Müler细胞可以促进视网膜内皮细胞的迁移,促进该细胞的增生.
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体外内层血视网膜屏障模型中Müller胶质细胞对紧密连接的影响
目的:建立体外内层血视网膜屏障(iBRB)模型并研究视网膜Müler胶质细胞(RMGC)对紧密连接(TJ)的影响.方法:采用免疫磁珠方法原代纯化和培养大鼠视网膜微血管内皮细胞(RMEC),采用改良酶消化方法培养RMGC,RMEC和RMGC在微孔膜的两侧共培养建立iBRB模型,通过相差显微镜和透射电子显微镜(TEM)观察两种细胞的生长和TJ的形态.采用跨内皮细胞电阻(TER)测量和TJ相关蛋白ZO-1荧光染色和蛋白电泳来评价TJ的变化情况.结果:RMEC和RMGC均可在膜上正常生长,RMGC间紧密连接.TEM观察高TER值样品中相邻RMEC形成典型的TJ结构.RMEC层TER在8d时达到高,为(86.3±7.9)Ω·cm2,此后保持相对稳定.在RMGC存在的共培养组TER 7d时为(97.6±3.6) Ω·cm2,约为7d时RMEC组的2倍,8d达到峰值(113.5±5.3)Ω·cm2.在iBRB模型发展过程中,ZO-1的表达强度随时间延长而增加.结论:通过RMEC和RMGC的共培养可以建立体外iBRB模型,RMGC加快RMEC间的TJ成熟.
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血脑屏障体外模型与药物转运研究
药物通过血脑屏障是发挥其中枢作用的关键.体外培养的微血管内皮细胞具有血脑屏障形态学、生化和功能方面的特性.内皮细胞和胶质细胞共培养保留了许多体外培养失去的特性.体外细胞培养模型测得的药物的通透性与在体实验相比有良好的相关性.体外模型适合于评价药物的通透性以及研究药物通过血脑屏障的转运机制.体外细胞培养模型是新药开发中预测其体内的通透能力的重要工具.
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过氧化氢对胰岛微血管内皮细胞钙非依赖型磷脂酶A2表达的影响
目的:研究过氧化氢(H2O2)对胰岛内皮细胞钙非依赖型磷脂酶A2(iPLA2)mRNA表达的影响.方法:用0,30,100和300 μmol/L H2O2诱导IMECs 8 h后进行RT-PCR检测;用300 μmol/L H2O2分别诱导0,4,8和12 h后应用RT-PCR技术进行iPLA2基因表达的检测.采用Annexin V-FTTC/PI双染色检测细胞的凋亡率;采用DIOC6(3)染色检测细胞线粒体膜电位.结果:①300 μmol/L H2O2作用12 h的电泳条带亮度与其他组(0,30,100μmol/L)相比明显减弱,300μmol/L H2O2作用8 h及12 h的电泳条带亮度与0,4 h相比明显减弱.②各浓度H2O2处理组(0,30,100和300 μmol/L)IMECs凋亡率差异具有统计学意义[分别为(2.0±0.5)%,(19.1±5.8)%,(28.4±4.9)%,(40.1±5.1)%,P<0.01];300 μmol/L H2O2处理0,4,8,12 h后,各时间点IMECs凋亡率差异具有统计学意义(P<0.01);③各浓度及各时间点H2O2处理组IMECs细胞内DIOC6(3)的荧光强度差异具有统计学意义(P<0.01).结论:H2O2对IMECs iPLA2的表达具有抑制作用,其抑制作用呈量效及时效关系.
