华佗再造浸膏对大鼠局灶性脑缺血/再灌注血脑屏障损伤的保护作用及机制研究

目的:观察华佗再造浸膏(Huatuo Zaizao extractum,HTZZ)对栓线法阻断大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion,MCAO)致大鼠局灶性脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)损伤的保护作用及其机制.方法:健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠60只,随机分为假手术组,MCAO模型组,达纳康组(20 mg·kg-1),HTZZ 高、中、低剂量组(5,2.5,1.25g·kg-1),每组10只,十二指肠单次给药.采用栓线法阻断大脑中动脉,建立大鼠局灶性I/R模型..缺血90min,再灌注24h后,HE染色观察缺血侧病理损伤,透射电镜观察血脑屏障结构,蛋白免疫印记法检测G蛋白偶联受体激酶2(C protein-coupled receptor kinases 2,GRK2),基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases,MMP-2)和MMP-9表达.结果:90min MCAO/24h再灌注半暗带皮层脑微血管呈现水肿、线粒体损伤、空泡化、膜损伤和微绒毛减少等.伴随这一变化,损伤侧皮层半暗带脑组织GRK2亚细胞分布从胞浆向胞膜转移,MMP-2和MMP-9表达升高.HTZZ可有效恢复脑缺血再灌注造成的脑微血管内皮水肿和血脑屏障超微结构损伤,减少功能性(膜偶联)GRK2表达,并抑制MMP-2和MMP-9表达.结论:细胞膜偶联GRK2可能是华佗再造丸的有效作用靶点.

α1Β-肾上腺素受体的磷酸化与减敏

α1Β-肾上腺素受体(α1B-AR)的减敏是一个复杂的过程,它包括同源性减敏和异源性减敏.同源性减敏主要是由G蛋白偶联受体激酶(GRKs)和arrestins介导的快速过程,同时可伴随异源性减敏发生.许多途径都可引起异源性减敏,在此简要综述了四种引起异源性减敏的途径:(1)非肾上腺素受体引起的蛋白激酶C激活引起α1Β-AR磷酸化或减敏; (2)激活与Gq偶联的受体,如ETA受体,使α1Β-AR磷酸化或减敏; (3) 激活与Gi偶联的受体,如溶血磷脂酸受体, 使α1Β-AR磷酸化或减敏; (4)受体通过内源性酪氨酸激酶活化引起α1Β-AR磷酸化或减敏. 所有这些减敏机制都只是初步探索,确切机制和意义有待进一步研究.

G蛋白偶联受体激酶2参与血小板活化因子致肺微血管内皮细胞损伤的机制

目的探讨G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)参与血小板活化因子(PAF)诱导大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)损伤的机制.方法在体外分离、培养PMVEC的基础上,采用微滤器检测PAF作用于PMVEC前后单层通透性的变化;用流式细胞仪检测F-肌动蛋白(F-actin)的变化;并用Western blot方法检测PMVEC 的GRK2表达,用佛波酯刺激PMVEC以观察GRK2的变化及其对单层通透性和F-actin的影响.结果 10 mg·L-1剂量的PAF 在120 min内可使PMVEC单层通透性增高、F-actin解聚,GRK2表达明显高于正常对照组,佛波酯刺激PMVEC可使GRK2表达进一步增高并可抑制PMVEC单层通透性增高和F-actin解聚.结论 PAF作用后可引起PMVEC 单层通透性增高和GRK2表达增加,且PMVEC F-actin解聚与单层通透性增高密切相关,GRK2表达增加可抑制PMVEC单层通透性增高和F-actin解聚,减轻PAF对PMVEC的损伤.

G蛋白偶联受体激酶的研究进展

G蛋白偶联受体激酶(GRKs)属丝氨酸/酪氨酸蛋白激酶家族,其亚型广泛存在于各种组织,能特异地使活化的G蛋白偶联受体(GPCR)发生磷酸化及脱敏化,从而终止后者介导的信号转导通路.现就G蛋白偶联受体激酶的结构、种类及分布、生物学功能及与疾病关系的新进展进行总结与概括,并对其发展进行了展望.

脂多糖对肺微血管内皮细胞β-受体及β-受体激酶影响的研究

为探讨脂多糖(LPS)对肺微血管内皮细胞β-受体(β-AR)及β-AR激酶的影响,在体外分离、培养大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)的基础上,采用放射性配基结合法检测LPS作用后RPMVEC β-AR的变化,并用Westem blot检测了LPS作用后β-AR激酶GRK2和GRK3的改变.结果发现,β-AR大结合容量Bmax LPS组显著低于正常对照组(P＜0.05),LPS+山莨菪碱组与正常对照组间无显著性差异;LPS组与LPS+山莨菪碱组间GRK2表达无明显差异,但均明显高于正常对照组;RPMVEC无GRK3表达.提示LPS作用后引起的RPMVEC β-AR下调可能与GRK2表达增加促进了β-AR内化有关,而与GRK3无关;山莨菪碱不是通过抑制GRK2表达而是通过其他机制抑制LPS引起的β-AR下调.

G蛋白偶联受体激酶活性调控及其在恶性肿瘤中的作用

G蛋白偶联受体(GPCR),是一类重要的细胞表面受体.G蛋白偶联受体激酶(GRK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,其亚型广泛存在与各种组织,能够特异性地使活化的GPCR发生磷酸化及脱敏,从而终止GPCR介导的信号转导通路.新的研究还发现,GRK不仅作用于GPCR,也可以通过使非GPCR磷酸化或通过非磷酸化作用参与信号转导.GRK不仅能够调节GPCR和非GPCR,其自身活性也可受到多种因素的调节.本文结合GRK的多种功能作用和GRK活性调控,对GRK在脑、内分泌、生殖系统、消化系统及黑色素肿瘤中的作用做简要综述.

脑组织特异表达hS100B转基因小鼠帕金森样运动协调能力改变的初步分析

目的 研究S100B在帕金森病发病机制中的作用并探讨脑组织特异表达hS100B转基因小鼠作为帕金森病模型小鼠的可能性.方法 构建hS100B转基因小鼠.小鼠分为S100B转基因组、基因敲除组和阴性对照组.爬杆法和转棒法检测运动协调能力;逆转录-PCR、Westem blot对脑组织中S100B、多巴胺D1、D2受体,G蛋白偶联受体激酶2、5及酪氨酸羟化酶的表达进行测定;高效液相色谱-荧光法检测脑组织中酪氨酸、左旋多巴、多巴胺及高香草酸的含量.结果 与阴性对照组相比,转基因组小鼠脑组织中S100B蛋白显著升高(P＜0.05),3月龄时可表现出运动协调能力下降,且随着月龄增加,运动协调能力下降呈明显的进行性降低(P＜0.05);脑组织中多巴胺D2受体、G蛋白偶联受体激酶2mRNA和蛋白表达降低(P＜0.05);左旋多巴、多巴胺、高香草酸生成增多,高香草酸/多巴胺比值升高(P＜0.05);酪氨酸羟化酶的表达虽呈下降趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05).S100B基因敲除小鼠脑组织中无S100B蛋白表达,与阴性对照组相比,各检测指标无异常(P＞0.05).结论 S100B很可能是参与帕金森病行为学异常的重要蛋白,脑组织特异表达hS100B转基因小鼠的建立为研究该基因在帕金森病中的作用提供了工具.

GRK5与持久兴奋βAR诱导心肌肥厚氧化应激途径的关系

目的 探讨持久兴奋β受体诱导病理性心肌肥厚机制中,氧化应激水平升高与GRK5之间的关系.方法 雄性SD大鼠(180～200g),按照随机原则分为对照组(CTRL)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)组(CTRL+NAC)、异丙肾上腺素(ISO)组(ISO)及ISO注射辅以NAC组(ISO+NAC),6只/组.ISO组通过腹腔注射给予IS0 3 mg/(kg·d),对照组给予腹腔注射等量生理盐水,NAC组通过饮用水给药15g/L,共2周,分别检测各组大鼠血压、心脏质量指数(HMI)、心肌组织学变化、心肌NOX4及GRK5的表达变化.结果 与CTRL组比较,ISO组大鼠HMI明显升高[(3.99±0.10) mg/gvs(3.31±0.13) mg/g],其差异有统计学意义(P＜0.05),心肌横截面积明显增大[(11 117.00±387.57) μm2 vs(4 572.23± 176.39)μm2],其差异有统计学意义(P＜0.05);ISO+NAC组大鼠的HMI[(3.56±0.12) mg/g]、心肌细胞横截面积[(6 160.33±141.44) μm2]均明显低于ISO组大鼠,其差异均具有统计学意义(P＜0.05);ISO组大鼠心肌NOX4蛋白表达水平明显高于CTRL组(10.59±1.61 vs 4.35±1.65),其差异具有统计学意义(P＜0.05),NAC明显降低了ISO诱导的NOX4表达增加(4.67±1.25 vs 10.59±1.61),其差异具有统计学意义(P＜0.05);用Westren blot、免疫组化技术检测心肌GRK5表达情况,结果显示ISO组与CTRL组、ISO+NAC组与ISO组差异均无统计学意义(P＞0.05);同时RT-qPCR技术检测心肌GRK5 mRNA表达水平亦发现ISO与CTRL、ISO+NAC与ISO组的差异均无统计学意义(P＞0.05);鼠尾动脉血压测量结果显示在4组实验动物间差异均无统计学意义(P＞0.05);NAC组各项指标与CTRL组大鼠无差异.结论 持久兴奋β AR诱发病理性心肌肥厚机制中,GRK5可能未参与氧化应激通路对致肥厚因子的调节,有待进一步体外实验证明.

胆碱能受体和肾上腺素能受体磷酸化的调节作用机制研究

目的:研究受体激活剂或抑制剂影响G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)介导的胆碱能m2受体和β2肾上腺素能受体膜蛋白(β2-AR)磷酸化的调节机制.探讨兴奋剂使m2受体和β2-AR受体活化,引发受体磷酸化级联反应,进而影响蛋白激酶催化受体磷酸化的起始机制.方法:制备亲和层析柱;利用亲和层析方法从大鼠脑中纯化毒蕈碱乙酰胆碱m2受体;分别将纯化的毒蕈碱乙酰胆碱m2受体或β-肾上腺素受体,G蛋白偶联受体激酶-2,[γ-P<'32>]ATP与受体激活剂或抑制剂共同保温,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,放射性自显影检测m2受体磷酸化结果.结果:m2受体激活剂氨甲酰胆碱明显增强m2受体的磷酸化,而m2受体抑制剂阿托品或肝素(GRK2抑制剂)完全阻断了m2受体的磷酸化.m2受体的磷酸化是依赖激活剂如氨甲酰胆碱作用发生的,呈明显的剂量依赖关系;β2-AR的激活剂特布他林增强肾上腺素能受体的磷酸化,而肝素可完全阻断β2-AR的磷酸化;并且证实氨甲酰胆碱对mAChR2,特布他林对β2-AR磷酸化的增强作用是选择性的作用结果;HEL299细胞磷酸化实验结果也显示氨甲酰胆碱可以增强HEL299细胞m2受体的磷酸化,阿托品可以抑制HEL299细胞m2受体的磷酸化.结论:实验证实氨甲酰胆碱、特布他林和阿托品等一些m2受体和β2-AR的激活剂及抑制剂对M2受体和β2-AR磷酸化的调节作用.提示激活剂增强m2受体和β2-AR的磷酸化可能是这些受体活化一个重要部分,由此开始加速受体敏感性下调,受体耐受性增强.

G蛋白β、γ亚基对M2受体的磷酸化的影响

目的:探讨G蛋白β、γ亚基在调节G蛋白偶联受体激酶活性的重要作用和G蛋白β、γ亚基影响M2受体磷酸化新的作用机制.方法:利用四个柱层析分离G蛋白α亚基与G蛋白β、γ亚基;将纯化的G蛋白β、γ亚基、GRK-2,[γ-P32]标记的ATP与mAChR2,共同保温,聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶片干燥后放射性自显影检测M2受体磷酸化结果.结果:G蛋白β、γ亚基在没有激动剂存在的情况下明显增强M2受体的磷酸化.氨甲酰胆碱明显增强M2受体的磷酸化,阿托品或肝素(GRK2抑制剂)完全阻断M2受体的磷酸化.M2受体的磷酸化是依赖激活剂如氨甲酰胆碱作用发生的,这种依赖关系呈明显的剂量关系.结论:G蛋白β、γ亚基是通过上调GRK2活性增强M2受体的磷酸化的.说明Gβγ/同 Go一样均可引起效应蛋白的激活,在细胞信号转导中起同样重要作用,共同介导一系列的生物学效应.

心脏β肾上腺素受体信号转导研究与相关药物研发

β肾上腺素受体作为重要的G蛋白偶联受体家族成员,在血液循环、代谢调节、肌肉收缩和舒张中都具有重要的作用.在心脏中,急性激活β肾上腺素受体能够促进心脏功能,持续性激活β肾上腺素受体在心脏重构的病理生理过程中具有重要作用.心脏中的β肾上腺素受体包括3个亚型:β1肾上腺素受体、β2肾上腺素受体和β3肾上腺素受体.文章重点讨论了β1和β2肾上腺素受体二者在心脏中不同甚至截然相反的作用.在此基础上,提出基于β肾上腺素受体信号转导亚型特异性的心衰治疗新方法.

胶原性关节炎大鼠滑膜组织G蛋白偶联受体激酶的表达及白芍总苷对其的影响

目的 研究胶原性关节炎(CIA)大鼠滑膜组织中G蛋白偶联受体激酶(GRKs)表达以及白芍总苷(TGP)对其的影响.方法 SD大鼠随机分成6组:正常组、模型组、TGP(25、50、100 mg·kg-1)组、雷公藤(GTW 40 mg·kg-1)组.用鸡Ⅱ型胶原建立CIA大鼠模型,Western blot检测滑膜组织GRKs表达水平,并观察TGP灌胃给药对其的影响.结果 正常SD大鼠滑膜组织GRK2、GRK5、GRK6均有表达,CIA大鼠关节滑膜组织GRK2、GRK5、GRK6的表达明显升高,TGP给药后GRK2,GRK5,GRK6的表达水平降低,差异有显著性.结论 CIA滑膜组织GRKs表达增加,TGP抑制这种异常的变化可能是其治疗CIA的机制之一.

螺内酯对糖尿病肾病大鼠肾脏GRKs与GPR17表达的影响与意义

目的 探讨螺内酯对糖尿病肾病大鼠肾脏G蛋白偶联受体激酶 (GRKs) 与G蛋白偶联受体17 (GPR17) 表达的影响.方法 将60只SPF级SD大鼠随机分为3组, 各组20只.对照组正常饲养, 其余2组制备糖尿病肾病模型, 螺内酯干预组每日以100 mg/kg的螺内酯灌胃.取24 h尿液和腹腔静脉血测定血脂、血糖与肾功能;取肾脏, 测定肾脏指数 (RI) 与肾小球硬化指数 (GI), 并采用WB实验测定GRK2、GRK3、GRK4和GRK6和GPR17表达.结果 与对照组相比, 模型组和螺内酯干预组RI和GI升高;与模型组相比, 螺内酯干预组RI和GI降低, 差异有统计学意义 (P＜0.05).与对照组相比, 模型组的24 h尿白蛋白、血尿氮素 (BUN) 、血肌酐 (Scr) 、血糖、总胆固醇 (TC) 及甘油三酯 (TG) 水平升高, 与模型组相比, 螺内酯干预组24 h蛋白尿、BUN、Scr水平均降低, 差异有统计学意义 (P＜0.05).与对照组相比, 模型组GRK2、GRK3、GRK4表达升高, GRK6和GPR17表达降低;与模型组相比, 螺内酯干预组GRK2、GRK3、GRK4表达降低, GRK6和GPR17表达升高, 差异有统计学意义 (P＜0.05).结论 螺内酯能够干预糖尿病肾病大鼠GRKs与GPR17表达, 其具体机制尚需探索.

G蛋白偶联受体激酶的研究进展

G蛋白偶联受体激酶(GRKs)是一簇与G蛋白偶联受体(GPCRs)失敏相关的激酶.GRKs的主要功能是介导GPCRs磷酸化,并与抑制蛋白arrestins协同作用促进GPCRs内化和与G蛋白失偶联,从而导致GPCRs的失敏.

毒蕈硷乙酰胆碱受体表达和功能的调节及其介导新的信号途径

毒蕈硷乙酰胆碱受体(mAChR)通过与G蛋白偶联介导信号转导过程.许多因素参与调节mAChR基因表达和亚细胞定位,包括发育调节因子、细胞因子等.脱敏和增敏是调节mAChR表达和功能的主要方式.参与mAChR脱敏过程的蛋白激酶包括:第二信使激酶、蛋白激酶A(PKA)和C(PKC)、G蛋白偶联受体激酶(GRKs)和有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等.mAChR除了通过介导经典的信号转导途径,还可以通过活化PTX非敏感型G蛋白介导G蛋白活化的内在调整K通道(GIRKs)的抑制.

海鞘G蛋白偶联受体激酶cDNA的克隆

目的从海鞘体内分离可能存在的编码G蛋白偶联受体激酶(GRK)的cDNA克隆,确定其分子特征、研究其转录产物表达情况.方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、序列分析、3′ RACE等方法.结果得到了海鞘的一种GRKcDNA克隆,将其命名为Ci-GRK1.从序列分析及分子遗传分析的结果可以看出Ci-GRK1与人类GRK5的同源性高,其次是果蝇GRK2.Ci-GRK1mRNA在海鞘胚胎发育的整个过程中及其在幼虫体内均有表达.结论 Ci-GRK1有可能在海鞘胚胎发育中起着非常重要的作用.

脂多糖对大鼠肺微血管内皮细胞G蛋白偶联受体激酶的影响

目的:鉴定大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)G蛋白偶联受体激酶(GRK)的亚型,并观察脂多糖(LPS)的影响.方法:在体外分离、培养RPMVEC的基础上,采用Westem blot方法检测GRK2和GRK3.结果:LPS组和LPS+山莨菪碱组GRK2表达明显高于正常对照组;RPMVEC无GRK3表达.结论:LPS引起RPMVEC膜GRK2表达增加可能与促进β肾上腺素受体(β受体)内化,从而导致β-受体下调有关,而与GRK3无关;山莨菪碱不能抑制LPS引起的GRK2表达增加.

脂多糖诱导肺损伤大鼠肺组织GRK2、GRK3变化的实验研究

目的:探讨脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)和GRK3的变化规律.方法:取Wistar大鼠12只,随机均分为2组,雌雄不拘.LPS组自尾静脉注射LPS 8 mg/kg,生理盐水(NS)对照组注射等量NS.90 min放血活杀后取肺脏,用Western blot检测两组GRK2、GRK3的变化.结果:LPS组GRK2表达显著高于NS对照组,LPS组和NS对照组GRK3均为阴性.结论:Wistar大鼠肺组织有丰富的GRK2表达,但不表达GRK3;内毒素性肺损伤大鼠肺组织GRK2表达显著增加,这可能是ALI大鼠肺组织β-AR下调和β-AR激动剂失敏的重要机制.

G蛋白偶联受体激酶在心血管疾病中的作用

严重创伤早期大鼠下丘脑G蛋白偶联受体激酶的变化

目的研究G蛋白偶联受体激酶(GRK)在大鼠下丘脑的分布和严重创伤后时相变化及其与应激早期下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)分泌的关系.方法采用胸部撞击和单侧股骨中段骨折进行致伤.50只成年Wistar大鼠随机分为正常对照组和创伤组,通过免疫组化实验研究GRK在下丘脑的分布,Western blot实验研究室旁核GRK的蛋白表达,RT-PCR技术研究室旁核CRH的转录活性.结果在下丘脑室旁核有GRK2/3的分布,但未发现GRK6的阳性染色;GRK2/3的总蛋白在创伤后30 min显著下降(P＜0.05),90 min恢复近正常水平;CRH mRNA表达在伤后30 min显著升高(P＜0.05),60 min、90 min的升高非常显著(P＜0.01).结论在创伤应激过程早期GRK2/3的蛋白表达受到了抑制,推测下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素1型受体(CRHR1)的同源性脱敏受到了抑制,间接促进了下丘脑室旁核CRH的分泌.