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疏肝调神针法对偏头痛大鼠受体活性修饰蛋白1、5-羟色胺1D受体表达的影响
目的:探讨疏肝调神针法对偏头痛大鼠三叉神经脊束核、中脑受体活性修饰蛋白1(RAMP1)、5-羟色胺1D受体(5-HT1DR)表达的影响,探讨本法治疗偏头痛的镇痛机制.方法:雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、疏肝调神组、普通针刺组,每组10只.疏肝调神组取“百会”“风池”“内关”“太冲”、普通针刺组取“百会”“风池”进行针刺,每次30 min,每日1次,共8d.针刺干预结束后,于大鼠颈后皮下注射硝酸甘油复制偏头痛模型.采用荧光定量PCR法、Western blot法检测大鼠三叉神经脊束核、中脑RAMP1、5-HT1DR的mRNA和蛋白表达情况.结果:与对照组比较,模型组三叉神经脊束核、中脑中RAMP1的mRNA、蛋白表达均显著升高(P＜0.05),5-HT1 DR的mRNA、蛋白表达均显著降低(P＜0.05).与模型组比较,疏肝调神组、普通针刺组三叉神经脊束核、中脑中RAMP1的mRNA、蛋白表达均明显降低(P＜0.05),5-HT1 DR的mRNA、蛋白表达均明显升高(P＜0.05).与普通针刺组比较,疏肝调神组三叉神经脊束核、中脑中RAMP1的mRNA、蛋白表达均明显降低(P＜0.05),5-HT1 DR的mRNA、蛋白表达均明显升高(P＜0.05).结论:疏肝调神针法对偏头痛的治疗作用可能与抑制中枢降钙素基因相关肽的表达、激活5-HT的表达有关.
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人受体活性修饰蛋白1基因修饰间充质干细胞对兔心肌梗死后心室重构的作用
目的 探讨腺病毒介导人受体活性修饰蛋白1 (hRAMP1)基因转染间充质干细胞(MSC)移植对心肌梗死后心肌纤维化和心室重构的影响及可能机制.方法 建立心肌梗死再灌注兔模型,随机分为hRAMP1组(高表达hRAMP1基因的MSC移植,n=10)、MSC组(无基因修饰的单纯MSC移植,n=10)和对照组(生理盐水注射,n=10).Western Blot检测心肌梗死后1、3、7和28 d心肌梗死局部基质金属蛋白酶9(MMP-9)和hRAMP1蛋白表达水平；同时行2,3,5三苯基氯化四氮唑染色检测心肌梗死面积,心肌组织Masson染色评价心肌梗死后胶原沉积和纤维化程度；超声心动图评价28 d时左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室射血分数(LVEF)及短轴缩短率(FS).结果 细胞移植后,与对照和MSC组相比,hRAMP1组的LVEF[(57.2±6.3)％比(36.2±2.2)％、(45.3±5.4)％]和FS[(29.2±2.4)％比(13.5±1.4)％、(19.4±2.4)％]均升高(均P＜0.05),而LVESD[( 7.9±0.8)比(12.7±0.9)、(10.4±0.9)mm]和LVEDD[(12.7士1.2)比(17.3±2.4)、(16.3±1.1)mm]、心肌梗死面积、胶原容积分数均明显降低,胶原沉积减少.免疫印迹结果显示,hRAMP1组MMP-9蛋白表达较对照、MSC组明显增高.结论 hRAMP1移植通过促进梗死区心肌组织MMP-9表达,降低梗死区胶原沉积,抑制心肌纤维化,进而改善心室重构,提高心功能.
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人受体活性修饰蛋白1基因修饰间充质干细胞调节兔心肌梗死后炎症及对其心脏修复的作用
目的 探讨腺病毒介导人受体活性修饰蛋白1( hRAMP1)基因转染间充质干细胞( MSC)移植对心肌梗死后炎症反应及心脏修复的影响及可能机制.方法 建立心肌梗死再灌注兔模型,分为高表达hRAMP1基因的MSC移植(MSChRAMP1)组(n=10)、无基因修饰的单纯MSC移植(MSCnull)组(n=10)和生理盐水注射组(对照组,n=10).分别于细胞移植前和梗死后1、3、7、14和28 d取静脉血标本,用ELISA法检测血浆肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-10水平,用Western blot检测1、3、7和28 d时心肌梗死局部NF-κB和hRAMP1蛋白表达水平,TTC染色检测心肌梗死面积,同时行心肌组织HE染色和Masson染色评价梗死后胶原沉积和纤维化程度以及心脏修复情况.结果 细胞移植后MSChRAMP1组的心肌梗死面积明显低于对照组和MSCnull组[(10.1±2.9)％比(30.6±2.7)％和(22.5±3.2)％,P＜0.05],免疫组化染色也显示MSChRAMP1组的胶原容积分数较低,差异有统计学意义.与对照组和MSCnull组比较,MSChRAMP1组梗死心肌组织中炎症调控因子NF-κB蛋白表达较低,且血浆中TNF-α水平较低[细胞移植后7 d:(97.2±6.7)pg/ml比(207.6±12.7) pg/ml和(153.2±9.9) pg/ml,P＜0.05],而IL-10水平较高[细胞移植后7 d:(238.5±17.5)pg/ml比(177.3 ±19.8)pg/ml和(244.6±27.3)pg/ml,P＜0.05].结论 MSChRAMP1移植通过抑制梗死后NF-κB蛋白表达降低血浆TNF-α水平、升高IL-10水平,从而有效地调控心肌梗死后炎症反应,降低心肌梗死面积和胶原纤维化形成,促进心脏修复.
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受体活性修饰蛋白1过表达对降钙素基因相关肽促MG-63增殖作用的影响
目的 探讨受体活性修饰蛋白1( receptor activity modifying protein 1,RAMP-1)过表达对降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)促进MG-63细胞增殖作用的影响,以期阐明神经多肽系统在口腔颌面部创伤修复中的机制.方法 传代培养MG-63细胞并按完全随机法分为3组:RAMP-1过表达组、空载体组、空白对照组.构建人RAMP-1真核表达载体并稳定转染至MG-63细胞中.实时聚合酶链反应、蛋白质印迹法和免疫荧光法分别检测降钙素受体样受体( calcitonin receptor-like receptor,CRLR)在细胞中的表达及在膜上的分布；在0、24、48、72、96 h时使用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)分别检测3组细胞增殖情况；分别在0、8、16、24 h时使用流式细胞仪收集并分析细胞周期.对蛋白质印迹法和实时聚合酶链反应结果进行单因素方差分析和多重比较检验,对细胞增殖和细胞S期百分率的结果采用双因素方差分析并对处理因素进行多重比较检验.结果 RAMP-1过表达组MG-63细胞的CRLR蛋白及mRNA表达水平明显高于其他两组(P＜0.05)；RAMP-1过表达组在24、48、72及96 h时的A值分别为0.628±0.175、0.896±0.592、1.055±0.004、1.179±0.618,均显著高于相同时间点其他两组A值(P＜0.05),在72 h时与空白对照组(0.786±0.048)差距明显.RAMP-1过表达组在0、8、16及24 h时S期百分率分别为(1.25±0.13)％、(68.79±0.56)％、(64.49±1.59)％、( 57.82±0.75)％,均显著高于其他两组(P＜0.01),在8h时与空白对照组[(41.235±1.773)％]差距显著.结论 RAMP-1过表达能促进MG-63细胞膜上的CRLR分布,增强CGRP对MG-63细胞的促增殖作用.
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高表达受体活性修饰蛋白1对血管紧张素Ⅱ和降钙素基因相关肽诱导的A10细胞降钙素受体样受体膜分布的影响
目的 探索受体活性修饰蛋白1(RAMP1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和(或)降钙素基因相关肽(CGRP)诱导的降钙素受体样受体(CRLR)在血管平滑肌细胞(VSMC)的表达和分布的影响,进一步揭示CGRP抑制VSMC增殖的机制.方法 通过酶切、连接、转化等方法构建pCDNA3.1(+)-RAMP1真核表达载体并稳定转染至鼠源性血管平滑肌细胞株A10中,获得稳定高表达RAMP1的细胞系.无转染细胞、转染空载体[pCDNA3.1(+)]细胞和RAMP1高表达组细胞[pCDNA3.1(+)-RAMP1]分别用AngⅡ 100 nmol·L-1、CGRP 100 nmol·L-1和CGRP+AngⅡ处理24 h,用MTT法检测细胞存活;逆转录PCR、Western印迹和免疫荧光法分别检测CRLR mRNA含量、蛋白表达及细胞膜分布.结果 单纯转染空质粒或RAMP1对细胞增殖无明显影响.AngⅡ处理对3种细胞存活的影响无显著差异.pCDNA3.1(+)-RAMP1细胞经CGRP处理24 h后,细胞存活明显高于其他两组细胞(P<0.05);经CGRP+AngⅡ处理,细胞存活明显低于其他两组(P<0.05).AngⅡ,CGRP和CGRP+AngⅡ处理对3种细胞CRLR mRNA表达无明显影响,但CGRP处理使pCDNA3.1(+)-RAMP1细胞中CRLR蛋白明显高于其他两种细胞(P<0.05),而CGRP+AngⅡ处理使pCDNA3.1(+)-RAMP1细胞中CRLR蛋白明显低于其他两种细胞(P<0.05).免疫荧光结果显示,经无血清或CGRP处理后,无转染细胞和pCDNA3.1(+)细胞中的RAMP1和CRLR主要分布在胞浆区域;经AngⅡ或CGPR+AngⅡ处理后,pCDNA3.1(+)-RAMP1细胞中RAMP1和CRLR在细胞膜上的分布多于无转染细胞和pCDNA3.1(+)细胞.结论 高表达RAMP1能增强CGRP抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖,其机制可能是通过RAMP1增加CRLR的膜分布,从而增强CGRP受体对CGRP的敏感性有关.
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腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡
背景:外源性受体活性修饰蛋白1 基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用.目的:探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1 基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响.方法:分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1 基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1 组、空病毒组和对照组.结果与结论:腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72 h 表达强,感染率达80%,96 h时仍有绿色荧光蛋白表达.人受体活性修饰蛋白1 组的受体活性修饰蛋白1 蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05).提示人受体活性修饰蛋白1 基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡.
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受体活性修饰蛋白1基因载体构建及其对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
目的 探讨受体活性修饰蛋白1(RAMP1)表达载体的构建及其高表达RAMP1对血管平滑肌细胞增殖的影响.方法 通过构建RAMP1大鼠基因开放阅读框的真核表达载体,利用脂质体将其转入原代培养的大鼠主动脉平滑肌细胞,G418筛选稳定表达细胞集落.逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹法检测RAMP1的表达量;MTT法测定细胞的增殖或生存率,并计算细胞倍增时间.结果成功构建RAMP1基因真核表达载体,脂质体能将RAMP1表达载体稳定转入血管平滑肌细胞,RAMP1高表达能明显增强降钙素基因相关肽抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞生存率及明显延长其倍增时间.结论 RAMP1高表达能增强CGRP抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖.
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受体活性修饰蛋白1促进成骨作用的研究进展
生理状态下,骨吸收与骨形成过程的动态平衡对维持骨组织功能至关重要.而在骨损伤状态下,如何通过促进骨形成,抑制骨吸收从而促进骨愈合过程一直是该领域研究的热点.近年来,受体活性修饰蛋白-1(RAMPl)在骨代谢过程中的调节作用已受到越来越多的关注.RAMP1广泛存在于骨组织中,它可以与不同的G蛋白偶联受体(GPCR)结合,修饰受体行为,调节相应的配体作用.此外,它还能进一步参与到受体介导的信号转导中,影响成骨相关细胞内蛋白的相互作用,从而影响成骨相关细胞增殖、迁移、分化等生物学特性.本文就近年来RAMP l促进成骨作用的研究作一综述.
