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PPARγ基因修饰对兔骨髓间充质干细胞成脂分化及ADRP、LPL表达的影响
目的 观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(MSCs)向脂肪细胞分化的影响,探讨PPARγ在脂肪细胞早期分化中可能的调控机制. 方法 原代培养新西兰大白兔MSCs,应用脂质体介导法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSCs中,G418筛选.分成不诱导组、空转染诱导组及转染诱导组以成脂诱导剂诱导分化,每日观察细胞形态学变化,镜下计数并计算脂肪细胞分化率,采用RT-PCR方法检测脂肪分化相关蛋白(ADRP)、脂蛋白脂酶(LPL)mRNA表达,Western blot检测ADRP、LPL蛋白表达. 结果 不诱导组细胞内没有脂滴出现,空转染诱导组和转染诱导组部分细胞成功分化为脂肪细胞,转染诱导组分化率明显高于空转染诱导组(P<0.05);不诱导组ADRP、LPLmRNA及蛋白均不表达,转染诱导组ADRP、LPLmRNA及蛋白表达水平显著高于空转染诱导组(P<0.05). 结论 PPARγ基因转染MSCs可促进其向脂肪细胞分化,增强其分化能力,可能与促进ADRP、LPL基因和蛋白的表达有关.
关键词： 过氧化物酶体增殖物激活受体 脂肪分化相关蛋白 脂蛋白脂酶 基因转染 -
周脂素和 ADRP在糖代谢异常大鼠肝脏组织中的表达
目的：探讨脂滴相关蛋白周脂素（perilipin）和脂肪分化相关蛋白（ADRP）在糖尿病发生发展过程中的变化情况以及在糖代谢异常合并非酒精性脂肪肝中的作用。方法：分别用高脂饲料喂养和高脂饲料喂养加小剂量链脲佐菌素建立糖耐量受损（IGT）和2型糖尿病大鼠模型（T2DM），采用光镜观察各组大鼠肝组织的形态学改变；用ELISA法测定血清周脂素perilipin和ADRP含量；real-time PCR技术检测肝脏组织中perilipin和ADRP mRNA的表达；用Western blotting法检测肝脏组织中ADRP蛋白的表达。结果：HE结果显示， IGT组和 T2DM组大鼠均有肝细胞脂肪变性，IGT组变性更严重；各模型组的生化指标与临床相关疾病的表现一致；血清perilipin水平各组之间无差异，但IGT组和T2DM组肝组织perilipin mRNA表达明显升高（P＜0.01）；与IGT组相比，T2DM组perilipin mRNA表达显著增加（P＜0.05）。 T2DM组血清ADRP含量较其对照组明显降低（P＜0.01）；模型组肝组织ADRP mRNA表达明显降低（ P＜0.01）；ADRP蛋白表达较其对照组也明显降低（ P＜0.01）；与IGT组相比， T2DM组ADRP mRNA表达明显降低（ P＜0.01）。结论：血清ADRP含量在T2DM的形成中起一定的作用，与胰岛素抵抗指数呈明显负相关；高脂喂养后能导致大鼠糖代谢异常，并伴有非酒精性脂肪肝的发生；糖代谢异常合并非酒精性脂肪肝的发生可能与肝组织perilipin表达升高和ADRP表达降低有关。
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低氧对L02细胞脂肪代谢的影响及其机制
目的 研究低氧对L02细胞脂质代谢的影响及其可能的机制. 方法 以正常人肝细胞株L02细胞为研究靶细胞,对照组和低氧处理组细胞分别在21％和1％氧浓度下培养.油红O染色、甘油三酯(TG)测定检测肝细胞脂肪变程度；RT-PCR法检测细胞内低氧诱导因子(HIF) 2α、固醇调节元件结合蛋白(SREBP) -lc mRNA的表达情况; Western blot法检测HIF-2α亚基、脂肪分化相关蛋白(ADRP)、脂肪酸合成酶(FAS)蛋白的表达量.各组甘油三酯测定值行2×3的析因设计方差分析；两样本均数间比较采用t检验；其他多个样本均数的比较采用单因素方差分析与NewmanKeulS法检验.结果 与对照组比较,低氧组L02细胞内出现脂质沉积,TG含量增多,且随低氧处理时间延长逐渐增多(F=115.04,P＜0.01).低氧12、24、48 h组SREBP-1c mRNA表达水平校对照组下调(0.236±0.043、0.287±0.044、0.342±0.049与0.503±0.037,F=28.37,P＜0.01),FAS蛋白表达水平较对照组下调(0.562±0.054、0.674±0.062、0.682±0.057与0.857±0.069,F=16.08,P＜0.0l).对照组未检测到HIF-2α表达,而低氧处理3h后HIF-2 α蛋白表达逐渐增加,6h后达高峰,12、24h又逐渐降低,各时间点分别为0.609±0.031、0.973±0.067、0.792±0.056、0.437±0.038(F=85.30,P＜0.01);低氧12、24、48h各组ADRP蛋白相对含量分别为0.319±0.043、0.732±0.056、0.873±0.066,均明显高于对照组0.211±0.019(P值均＜0.05),且随低氧时间延长,表达量逐渐增多(F=167.49,P＜0.01).结论 低氧通过HIF-2 α-ADRP途径诱导肝细胞脂肪沉积.
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非酒精性脂肪性肝病发生中Perilipin和ADRP表达变化实验研究
目的:探讨高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)形成过程中,肝组织Perilipin(脂滴包被蛋白)和ADRP(脂肪分化相关蛋白)的表达变化及意义. 方法:建立大鼠高脂饮食NAFLD模型并设正常对照组,观察时间点为建模后4 w、8 w和12 w,观察大鼠肝组织病理变化,检测血浆游离脂肪酸及甘油三酯水平,免疫组织化学染色法检测肝组织中Perilipin和ADRP蛋白水平.结果:成功制作大鼠NAFLD实验模型,与正常组相比,NAFLD组大鼠血浆FFA水平和TG水平从第4 w起显著升高(P＜0.01),NAFLD组大鼠肝组织Perilipin蛋白表达水平显著低于正常组(P＜0.01),ADRP蛋白表达水平显著高于同期正常组(P＜0.01).Perilipin及ADRP表达与FFA及TG具有显著相关性. 结论:高脂饮食可制作NAFLD大鼠模型,Perilipin和ADRP与NAFLD的形成有关.
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脂肪分化相关蛋白对软脂酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响
目的:构建编码脂肪分化相关蛋白(ADRP)基因全长序列的真核表达载体,探讨ADRP过表达对软脂酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡有何影响.方法:(1)采用PCR的方法,以成年SD大鼠心肌cDNA为模板扩增编码ADRP全长的DNA序列,重组入pEGFP-C1质粒表达载体中,酶切、测序鉴定后转化大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,扩增后提取质粒,进行酶切和测序鉴定;(2)采用脂质体转染法将鉴定后的重组质粒转染H9c2心肌细胞株,经G418筛选获得抗性细胞克隆后扩大培养;荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白报告基因表达情况;RT-qPCR和Western blot检测转染细胞与正常细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平;(3)采用流式细胞术检测不同浓度软脂酸对上述细胞细胞凋亡率的影响.结果:(1)酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入表达质粒pEGFP-C1;(2)荧光显微镜观察细胞内有绿色荧光蛋白表达且传20代以上无消失;RT-qPCR和Western blot证明重组质粒转染H9c2细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平明显高于空质粒转染组和正常对照组(P<0.01);(3)经不同软脂酸刺激后,重组质粒转染H9c2细胞凋亡率明显低于空质粒转染组和正常H9c2细胞组(P<0.05).结论:(1)成功构建了H9c2细胞真核质粒表达载体pEGFP-C1-ADRP,获得了稳定表达ADRP基因的H9c2心肌细胞株;(2)ADRP能够抑制软脂酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡,表明ADRP对高脂环境中心肌细胞可能具有一定的保护作用.
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脂肪分化相关蛋白在巨噬细胞和泡沫细胞中的表达
目的:观察脂肪分化相关蛋白(ADRP)在单核细胞向巨噬细胞和泡沫细胞分化过程中的表达变化.方法:体外诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞和泡沫细胞,应用Real time RT-PCR和Western blot测定ADRP在基因水平和蛋白水平的表达.结果:单核细胞分化为巨噬细胞时ADRP的表达水平无明显变化,当进一步分化为泡沫细胞时,ADRP的mRNA和蛋白表达水平均显著增加.结论:单核细胞向巨噬细胞分化时对ADRP的表达无影响,而由巨噬细胞进一步向泡沫细胞分化时ADRP的表达升高.
