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灵芝三萜化合物的抗肿瘤靶点预测与活性验证
研究发现灵芝三萜类化合物具有抗肿瘤活性,但其作用靶点尚不清楚,该试验主要研究灵芝三萜类化合物的抗肿瘤活性并对其可能的作用靶点进行预测.采用Discovery Studio软件的LibDock模块,以灵芝子实体中的26种三萜类化合物作为配体,分别与抗肿瘤作用明确的11个靶点蛋白进行分子对接,获得对接的打分结果,评判配体与靶点蛋白受体结合的亲和力,从而进行灵芝三萜类化合物抗肿瘤的虚拟筛选,探讨可能的作用靶点.同时,MTT实验检测26种灵芝三萜类化合物对5种肿瘤细胞的抑制能力,计算IC50,以此反映化合物的抗肿瘤活性.对接结果表明,对接位置数目大于5,且对接得分高于100,可以作为判断化合物是否具有活性的阈值,据此筛选出8种灵芝三萜类化合物可能具有抗肿瘤活性,其中5个具有多靶点作用的三萜成分.MTT细胞实验显示,灵芝酸Y对肺癌细胞H460显示了一定的抑制活性,IC50为22.4μmol·L-1,其次是7-oxo-ganoderic acid Z2,IC50为43.1μmol·L-1.其他三萜类化合物对被测肿瘤细胞株未显示活性或活性很弱.该研究建立的分子对接虚拟筛选方法可用于灵芝抗肿瘤活性成分的初步筛选,通过该方法的筛选,结合MTT细胞毒活性实验结果,发现灵芝酸Y具有抗肿瘤,尤其抗肺癌开发的潜在可能性,7-oxo-ganoderic acid Z2和ganoderon B具有一定的抑制活性,其抗肿瘤作用有待于进一步深入研究,该研究结果可为抗肿瘤药物的研制提供参考.
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HPLC法测定灵芝子实体和孢子粉中灵芝酸C2、灵芝酸G和灵芝酸A
目的 建立灵芝子实体和孢子粉中3种灵芝酸类成分的HPLC测定方法,为全面评价灵芝药材和孢子粉的质量提供依据.方法 采用HPLC方法测定,Diamonsil(钻石)C8色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相乙腈-0.03％磷酸(28∶72),体积流量1.2 mL/min,检测波长250 nm;柱温35℃.结果 灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸A分别在0.40～10.06 μg(r=0.999 99)、0.40～10.00 μg (r=0.999 99)、0.40～10.00 μg(r=0.999 99)线性关系良好,平均回收率分别为101.04％、99.39％、101.22％,RSD值分别为1.64％、1.86％、2.20％(n=6):灵芝子实体中3种灵芝酸的质量分数分别在0.06～0.29 mg/g、0.12～0.37 mg/g、0.19～0.41 mg/g,灵芝孢子粉供试品中3种灵芝酸的质量分数分别在0～0.01 mg/g、0、0～0.03 mg/g.结论 本方法简便,稳定,可用于灵芝三萜类成分C2、灵芝酸G、灵芝酸A的定量分析.
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反相高效液相色谱法测定灵芝子实体中灵芝酸A的含量
目的 建立测定灵芝子实体中灵芝酸A含量的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定方法.方法 采用Promosil-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-体积分数0.03％甲酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速为0.8 ml/min,检测波长254 nm.结果 灵芝酸A的质量浓度在1.1～11μg范围内与峰面积呈良好线性关系,r=0.999,Y=1.121X-0.112,RSD=1.61％(n=6).结论 RP HPLC测定方法简便、快速、准确、重复性好,可用于控制灵芝子实体的质量.
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赤灵芝子实体中塑化剂单体检测及其迁移分析
目的 了解椴木赤灵芝的主要产地武夷山地区灵芝子实体中塑化剂的污染水平,并分析在生产过程中主要原料向子实体中的迁移情况.方法 依据国家食品污染监测标准操作程序,对武夷山地区的3个赤灵芝种植基地内采集的鲜品、干品灵芝子实体进行包括邻苯二甲酸二(2一乙基己基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丁基酯(DBP)等16种塑化剂单体的检测分析.对3个基地内的赤灵生长基质中的主要塑化剂富集物水、椴木和辅助材料进行塑化剂单体监测,对灵芝子实体中塑化剂的迁移及来源进行检测结果分析.结果 灵芝子实体中,我国规定的DEHP、DBP均检出,DEHP为1.5 mg/kg左右,有1个基地超标,DBP的浓度为0.35 mg/kg～0.58 mg/kg,为超标项目.从生产环境和生产基质来看,DEHP某种程度表现为水体污染.结论 赤灵芝种植过程中可能存在塑化剂迁移污染,引水时常用的2种塑料管道,是2种塑化剂单体DCHP和DEHP的可能来源.
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HPLC法测定不同品种及段木栽培灵芝子实体中麦角甾醇含量
目的:以麦角甾醇为测定指标,建立灵芝子实体质量评价的HPLC方法,对不同品种及段木栽培灵芝子实体中麦角甾醇的含量进行比较研究.方法:采用HPLC法定量分析17个不同品种及14个不同段木树种的栽培灵芝子实体.色谱柱:Diamonsil C(18),流动相:乙腈,流速:1.0 mL/min,柱温:40 ℃.检测波长:282 nm.结果:确定了灵芝子实体中麦角甾醇的提取方法和HPLC含量测定方法.不同品种麦角甾醇含量范围为0.093%-0.243%,其中韩芝-2号、圆芝、明-1、野生1号同时具有较高的麦角甾醇含量和转化率;不同段木树种麦角甾醇含量范围为0.080%-0.227%,以白栎、杨梅的麦角甾醇含量及转化率均较高.结论:本方法操作简便、结果准确,可用于灵芝子实体中麦角甾醇的含量测定和灵芝质量评价研究.为人工栽培灵芝的品种及段木树种的选择提供了参考.
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灵芝三萜类化合物的体外抗肿瘤活性研究
目的 研究灵芝三萜类化合物在不同肿瘤细胞上的抗肿瘤活性.方法 四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测3种灵芝三萜化合物对5种肿瘤细胞的抑制能力,绘制抑制曲线,并计算IC50,反映化合物的细胞毒活性.结果 体外实验显示,3种灵芝三萜类化合物单体对5种肿瘤细胞表现出不同程度的抑制作用,其中灵芝酸Y的抑制作用比较强,对肺癌细胞H460的IC50为22.4μmol/L,其次是7-oxo-ganoderic acid Z2,IC50为43.1μmol/L.3种化合物灵芝酸Y、7-oxo-ganodericacid Z2和ganoderon B对其他被测细胞株未显示活性或活性很弱.结论 灵芝酸Y对肺癌细胞H460显示了较强的抑制活性,7-oxo-ganoderic Z2对肺癌细胞H460显示了一定的抑制活性,且抑制作用具有剂量依赖性.灵芝酸Y和7-oxo-ganoderic Z2的抗肺癌作用有待于进一步深入研究.
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灵芝子实体和孢子粉三萜含量的测定及体外抗肿瘤活性的评价
目的 测定灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉中的三萜含量,并评价其醇提物的体外抗肿瘤活性.方法采用高氯酸显色法测定灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉中的三萜含量,采用磺酰罗丹明B蛋白染色法( sulforhodamine B, SRB) 评价灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉醇提物对宫颈癌HeLa细胞、结肠癌HCT-116细胞和乳腺癌MCF-7-ADM细胞的体外抗肿瘤活性.结果研究的灵芝子实体中三萜质量分数为0.92％,破壁灵芝孢子粉供试品中三萜质量分数实测值为2.95％,但是灵芝孢子粉中脂肪油对高氯酸显色法有极大的干扰,因此破壁灵芝孢子粉三萜的实测值可能远高于实际值.活性评价结果显示,灵芝子实体的醇提物在100 μg /mL时,其对人宫颈癌HeLa细胞和乳腺癌MCF-7-ADM细胞表现出了较强的抑制作用,抑制率分别为94.54％和71.30％;对结肠癌HCT-116细胞表现出较弱的抑制作用,抑制率为20.68％.破壁灵芝孢子粉的醇提物在100 μg /mL和10 μg /mL时,其对宫颈癌HeLa细胞表现出了弱的抑制作用,对另外2种细胞系仅在100 μg /mL时表现出较弱的抑制作用.结论灵芝子实体的醇提物含有三萜并具有较好的抗肿瘤活性,可以将其开发为辅助治疗癌症的药物或保健品.含有脂肪油的灵芝孢子粉直接采用高氯酸比色法测定会高估其三萜的含量,需要进一步开发准确、可行的测定方法.
