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凡纳滨对虾白斑综合征病毒广西株变异区基因的比较分析
对凡纳滨对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)广西株变异区ORF14/15基因序列进行比较分析,了解WSSV广西株遗传进化差异及其与各地WSSV毒株间的遗传进化关系.考虑地理和时间因素选取2010年5月至2013年7月采自广西凡纳滨对虾主要养殖地区北海、钦州和防城港的40份WSSV阳性的凡纳滨对虾样品,PCR扩增、克隆样品中WSSV的ORF14/15基因并对其进行序列测定与比较分析.40份样品中有25份的ORF14/15基因被成功克隆和测序,其中22株为619 bp,3株为620 bp;相对于此区域为完整的TH-96-Ⅱ株,25株WSSV广西株的ORF14/15基因均在中间缺失了5 949 bp,仅剩5′端的190 bp和3′端的429 bp(430 bp),与印度株IN-05 Ⅰ缺失大小和位置相同;在变异区25株WSSV广西株中有16株核苷酸序列同源性为100％,其余毒株间的同源性也在97.9％以上,仅存在单个碱基的变异;基于变异区构建的系统进化树显示,WSSV广西地方株在遗传上相距较近,全部与印度株IN-05-Ⅰ聚在一个大的分支,而与目前发表的其他毒株均相距较远.广西养殖凡纳滨对虾中流行的WSSV毒株变异区ORF14/15基因的变异类型为中间大片段缺失,广西各地流行的WSSV毒株间无明显的地域和时间差异;WSSV广西株与印度株IN-05-Ⅰ的遗传进化关系近.
关键词： 凡纳滨对虾 白斑综合征病毒 ORF14/15基因 序列分析 -
多重RT-PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用
根据基因库中对虾桃拉综合征病毒(TSV)、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(I-HHNV)的基因序列,分别设计了三对特异性引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别TSV、WSSV和IHHNV的多重RT-PCR.该技术对同一样品中的TSV RNA、WSSV DNA和IHHNV DNA模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与实验设计相符的231bp(TSV)、593bp(WSSV)和356bp(IHHNV)的特异性多重RT-PCR扩增带,对其它对虾病原核酸的扩增结果为阴性.敏感性试验结果表明,该技术低能检测到10pg TSV RNA、100pg WSSV DNA和100pg IHHNV DNA.临床检测试验结果表明,该技术对TSV、WSSV和IHHNV的检出率明显高于传统的临床症状观察和组织病理学检查,提示该技术适用于这三种病毒的临床快速检测和鉴别诊断.
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白斑综合征病毒胶体金免疫层析试剂板的研制
目的 研制检测对虾中白斑综合征病毒(white spot syndrome virum,WSSv)的胶体金免疫层析试剂板.方法 分别制备抗WSSV单克隆抗体和多克隆抗体,并用胶体金标记单克隆抗体,将胶体金标记的抗WSSV单克隆抗体包被在金标垫上,抗WSSV多克隆抗体和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上,组装成试剂板,通过双抗体夹心法检测样品中WSSV含量.确定试剂板检测WSSV的低检出限,验证其特异性,并检测其与ELISA结果的符合率及稳定性.结果 该试剂板对WSSV的低检出限为1.0 mg/kg,特异性强,与ELISA实验结果相符,在室温条件下(20 ～ 25℃)可保存12个月.整个检测所需时间为8～ 10 min.结论 该试剂板能快速有效地筛查WSSV,适合现场快速检测.
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用简并寡核苷酸探针筛选对虾白斑综合征病毒DNA多聚酶基因片段
根据一些病毒的DNA多聚酶氨基酸序列中特有的保守序列VYGDTD设计的简并寡核苷酸,经地高辛标记后与对虾白斑综合征病毒基因库克隆杂交,筛选出一段长度为707 bp的EcoR I基因片段,该片段在一个开放阅读框内.并含DNA多聚酶B家族特有的保守序列YGDTDS.经与基因库比较,其氨基酸序列与藻类DNA病毒科(Phycodnaviridae)的几株藻类病毒的DNA多聚酶片段有部分相似,因此推测该核苷酸片段为对虾白斑综合征病毒DNA多聚酶基因的部分序列.
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斑点杂交检测对虾白斑综合征病毒青岛株在螯虾体内的动态分布
近年来，我国学者对人工养殖对虾暴发性病毒病的病原进行了较为系统的研究［1～5］ ，本试验应用螯虾这一动物模型［6］，利用斑点杂交方法，研究了白斑综合 征病毒（WSSV, 前称无包埋体对虾病毒 Non-Occluded-Shrimp Virus NOSV）青岛株在螯虾 体内的动态分布，为研究该病毒的传播途径、增殖致病机理提供了参考。
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实时荧光定量PCR法检测对虾白斑综合征病毒
对虾白斑病由白斑综合征病毒(WSSV)感染引起,所有养殖对虾对该病高度易感,蟹类、小龙虾、淡水虾以及各种龙虾也易感,但发病率和死亡率有很大差别.多种虾类常表现为持续感染或终身隐性感染.隐性感染虾体内的病毒含量极低,需建立一种快速、灵敏、准确的检测方法.本文应用TaqMan探针技术设计了探针和引物,建立了检测WSSV的实时荧光定量PCR方法.对影响PCR反应的主要因素Mg2+浓度和退火温度等进行了优化,证明当Mg2+浓度为3.5～4.0 mmol,退火温度为59～60℃时可获得佳的扩增和检测效果.
