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突破腺相关病毒载体包装容量限制的策略
腺相关病毒(Adeno-Associated Virus)为非致病性单链DNA微小病毒,野生型病毒仅仅在腺病毒等辅助病毒存在的情况下才会感染人体,对人体组织,特别是肝、脾等有很强的亲嗜性,可感染分裂和非分裂细胞,并定点整合到19号染色体.重组腺相关病毒(rAAV)载体虽然丧失了定点整合的特性,但是腺相关病毒转导的以附着体(Episome)形式存在的目的基因仍可在细胞内长期持续稳定表达.由于腺相关病毒有以上一些优点,因此被广泛应用于基因治疗的研究中,并且在某些遗传性疾病如血友病B临床试验中已经取得了非常好的效果.
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腺相关病毒载体介导的Endostatin及K1-5蛋白抗肿瘤血管生成协同作用
为研究腺相关病毒载体介导的内皮抑素(Endostatin)及K1-5蛋白抗肿瘤血管生成协同作用,实验中用含有Endostatin及K1-5基因的重组病毒rAAV-hE和rAAV-K5分别感染BHK-21细胞,并表达分泌出内皮抑素和K1-5蛋白,EIA法测定培养液上清中内皮抑素浓度达36.42ng/ml,免疫斑点印迹实验表明rAAV-K5可介导K1-5的体外表达.重组腺相关病毒(rAAV)介导所表达的内皮抑素和K1-5蛋白对血管内皮细胞增殖具有抑制作用.二者对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)的抑制率分别为68.1%和63.1%,对牛毛细血管内皮细胞(BCE)的抑制率分别为41.6%和34.0%.同时二者还有协同效应,用rAAV-hE和rAAV-K5同时感染BHK-21细胞,表达产物对人脐静脉内皮细胞和牛毛细血管内皮细胞的抑制率分别为70.8%和43.8%.动物实验表明,重组病毒rAAV-hE和rAAV-K5转入荷有人肺肿瘤细胞的裸鼠,对肿瘤细胞生长具有抑制作用,同时二者具有协同抗肿瘤作用.
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腺相关病毒载体转染供肝方法学的实验研究
目的 探讨腺相关病毒载体基因转染的有效途径和方法.方法 我们设计肝动脉、门静脉、双重灌注3种途径和传统、循环、夹闭3种转染方法.通过观察肝脏灌注后颜色、检测肝脏功能和肝细胞转染率,确定灌注途径和转染方法,并探讨其安全性.结果 肝脏灌注后颜色无明显差别,无肿胀或花斑出现,血流开放以后肝脏颜色迅速恢复正常,3种灌注途径ALT比较差异无统计学意义(F=0.343,1.265,0.055,P＞0.05);1周后肝脏组织均有免疫荧光染色,并且携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体,转染率比较差异无统计学意义(F=0.080,0.091,0.045,P＞0.05).传统法的转染率略低于循环法,而夹闭法的转染率在各时间段均高于前两种方法,差异有统计学意义(F=3.880,2.976,5.129,P＜0.05).3种方法转染率随时间逐渐升高,6周左右达到高峰,以后缓慢下降.结论 经肝动脉灌注是基因转染的有效途径,夹闭法可以提高目的基因的转染率,两者均无肝脏功能损害,腺相关病毒载体的转染呈缓慢、持续的过程.
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腺相关病毒载体在各种细胞株中的感染效率及表达特性研究
目的：研究腺相关病毒载体(AAV)感染各类正常细胞和肿瘤细胞的效率，为相关研究提供参考。方法：利用脂质体将重组腺相关病毒的包装质粒AAV-DJ、Helper以及表达绿色荧光蛋白(GFP)的穿梭质粒AAV-GFPP转染293FT细胞进行病毒包装，收集病毒液后感染2种正常细胞和14种肿瘤细胞，24 h后倒置荧光显微镜下观察GFP的表达，并随机选取3个视野统计感染GFP的细胞数目。结果：GFP重组腺相关病毒对各种细胞的感染效率存在差别，感染效率高的为293FT细胞(占96.2%)和Hela细胞(占81.86%)，对SCG7901、SEM-M和SP20细胞的感染效率近乎为零。结论：GFP重组腺相关病毒对正常细胞293FT感染效率高，对肿瘤细胞Hela、SMC7721、BGC823、PANC-1、A549、A875、C6和MCF-7的感染效率较高，这类细胞适合使用AAV作为载体进行外源基因的导入及功能研究。
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腺相关病毒载体基础研究及其在造血系统的应用进展
基因转移方式分为病毒载体和非病毒载体两类。前者常用的病毒有反转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)及人免疫缺陷病毒(HIV)等；后者有物理和化学方法等。病毒载体各有优点及局限性。近年来腺相关病毒载体基础研究以及在造……
