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Brd4在HPV E2蛋白转录调节中的作用
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)引起的宫颈癌患者日益增加,而HPV E2蛋白在宫颈癌发生和发展过程中起着重要作用,对其功能尚在研究中,本文就近年对Brd4在HPV E2蛋白转录调节中的作用研究作一综述.
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人乳头瘤病毒1 8型E2蛋白抗体制备及鉴定
18E2蛋白,提示具有较高抗体滴度和较强特异性.结论 以原核表达系统表达并纯化的全长HPV18E2蛋白免疫日本大耳白兔,制备得到了多克隆抗体能够检测真核细胞表达的E2蛋白,为进一步研究HPVl8E2提供了有用的工具.
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Brd4与HPV-16病毒E2在宫颈脱落细胞中的表达及意义
探讨宿主蛋白Brd4与HPV-16病毒E2蛋白在宫颈脱落细胞中的表达与临床意义.方法:收集150例HPV-16阳性的宫颈脱落细胞标本,细胞学分组:正常组30例、ASCUS组46例、LSIL组23例、HSIL组31例、宫颈癌组20例.其中细胞学诊断为ASCUS及以上级别的病例120例,经组织病理学分组:宫颈炎组21例、CIN Ⅰ组25例、CINⅡ/Ⅲ组45例、宫颈浸润癌组29例.Western blot检测标本中Brd4和E2蛋白的表达,比较两者在各组中的表达差异.结果:细胞学分级ASCUS及以上各组与正常组比较,Brd4和E2蛋白的阳性表达率均降低;在HSIL组和宫颈癌组的阳性表达率低于ASCUS组和LSIL组(P＜0.05).Brd4和E2蛋白在宫颈炎组和CIN Ⅰ组的表达差异无显著性(P＞0.05);从CIN到宫颈浸润癌,其表达呈下降趋势(P＜0.05).Brd4与E2蛋白的表达缺失用于筛查ASCUS中潜在高级别病变的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为0.93、0.94、0.88、0.98与0.80、0.95、0.86、0.93.结论:Brd4-E2复合体的解体,E2的表达缺失,在HPV诱导宫颈细胞癌变的过程中起重要作用.检测Brd4与HPV-16 E2蛋白的表达对ASCUS的分流、宫颈癌的筛查有一定的参考价值.
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GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在真核细胞内的表达与定位
目的:研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白在巨噬细胞(MΦ)内的表达与定位.方法:将真核表达载体pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD和pEGFP-C1/DBD及pEGFP-C1分别转染MΦ,48h后用倒置荧光显微镜观察荧光情况,以确定GFP及融合蛋白的表达;以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测相应蛋白质的表达.结果:在荧光显微镜下,4种质粒转染的细胞,pEGFP-C1组细胞内均有荧光;pEGFP-C1/E2组荧光主要在细胞核,但细胞浆也有;pEGFP-C1/DBD仅在细胞核有荧光,pEGFP-C1/TAD仅在细胞浆有荧光.Western blot检测到GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在细胞内的表达.结论:GFP-E2及其突变体融合蛋白均能在巨噬细胞内表达,且GFP-E2主要定位于细胞核,GFP-DBD定位于细胞核内,GFP-TAD定位于细胞浆.
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HPV18型E2蛋白高表达对巨噬细胞凋亡及其分泌功能的影响
目的:研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白瞬时高表达对巨噬细胞(MΦ)凋亡及分泌活性的影响,为进一步研究E2蛋白在HPV18致癌机制中的作用奠定实验基础.方法:通过PCR从现有真核表达载体pEGFP-C1/E2上分别扩增出TAD、DBD基因片段,并构建真核表达载体pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD.将3种真核表达载体及pEGFP-C1分别转染MΦ,用倒置荧光显微镜观察它们的表达与定位,并以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测它们的表达.通过3种融合蛋白在MФ内的瞬时高表达,在转染48 h后分别检测各组细胞培养基中TNF-α和IL-1β的含量,并收集MΦ经染色以及流式细胞术(FCM)观察检测其凋亡.结果:GFP-E2融合蛋白主要表达于细胞核,细胞质内也有表达,而GFP-DBD融合蛋白仅表达于细胞核内,GFP-TAD仅表达于细胞质.GFP-E2、GFP-TAD融合蛋白在MΦ内高表达后MΦ凋亡率上升,细胞因子TNF-α和IL-1β分泌量增加,且GFP-TAD作用强于GFP-E2.而EGFP-DBD无此作用.结论:HPV18 E2及其TAD与EGFP融合蛋白瞬时高表达可诱导MΦ凋亡并上调其分泌细胞因子TNF-α和IL-1β.
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人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备
目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清.方法 采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21 b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物.经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白.免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功.表达蛋白相对分子质量(Mr)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清.
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Caski 细胞内 Daxx 与 HPV16 E2蛋白的结合作用
目的：研究人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白在 Caski 细胞内与 Daxx 的相互作用，探讨它们在 HPV16所致宫颈癌发生发展中的作用。方法利用间接免疫荧光染色技术观察 HPV16 E2和 Daxx 在 Caski 细胞中的分布或共定位；通过免疫共沉淀试验和免疫印迹分析 HPV16 E2与 Daxx 在 Caski 细胞内的相互作用。结果在 Caski 细胞内，Daxx 和 HPV16 E2主要分布于胞浆，少数分布于胞核，且两种信号在细胞浆内有一定的共存；抗 E2抗体能沉淀Daxx，反之抗 Daxx 抗体同样能够沉淀 HPV16 E2。结论HPV16 E2与 Daxx 在 Caski 细胞存在直接的相互作用。
