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miR-1247-5p对Smad2基因的靶向调控作用
目的 利用miR-1247-5p过表达模拟物mimics,研究miR-1247-5p对TGF-β信号通路中关键蛋白Smad2的靶向调控作用.方法 合成模拟miR-1247-5p过表达的模拟物mimics,及抑制miR-1247-5p表达的抑制物inhibitors;同时构建与miR-1247-5p互补靶基因Smad2的3'非翻译区,将其克隆到线性化的Report荧光报告载体中.将测序鉴定阳性的report-Smad2 3'-UTR重组质粒,与miR-1247-5p的mimics/inhibitors共转染至HEK-293T细胞,通过relative luciferase activity实验验证靶向关系,并通过Western blot实验进一步检测Smad2蛋白表达水平.结果 成功构建report-Smad2 3'-UTR重组质粒,Western blot实验表明转染miR-1247-5p mimics组中Smad2蛋白表达下调(P＜0.05);而转染miR-1247-5p inhibitors组中,Smad2蛋白表达上调(P＜0.05).结论 证实miR-1247-5p直接靶向TGF-β信号通路中关键蛋白Smad2的表达,在蛋白水平对其进行调控,为进一步研究miRNA在细胞通路中的调控作用提供了依据.
关键词： miR-1247-5p TGF-β信号通路 Smad2基因 肿瘤 -
膀胱癌18q缺失做图与Smads蛋白表达分析
目的研究18号染色体短臂的杂合性缺失在膀胱癌发生发展中的作用，为早诊及定位克隆相关基因提供资料。方法利用位于18q上的12个多态性微卫星位点进行缺失做图，并对此区域的抑癌基因Smad 2和Sma d 4进行免疫组织化学分析。结果 84.2%（32/38）的病例至少在12个位点中的一个发生杂合性缺失，小缺失区域跨越Smad 4基因。免疫组化结果显示：Smad 2蛋白有21.1%（8/38）表达上调，34.2%（13/38）表达下调；Smad 4蛋白有68.4%（26/38）表达下调而仅1例表达上调。结论 18号染色体短臂的缺失与膀胱癌变相关。位于18号染色体短臂的两个候选抑癌基因Smad 2和 Smad 4的异常表达，对于膀胱癌的发生、发展可能有着重要作用。
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胎儿和出生后机体皮肤内转化生长因子-β1基因表达的变化
目的探讨转化生长因子-β1 (TGF-β1)及其转录因子smad2和smad3基因在不同胎龄的胎儿和出生后机体皮肤组织中表达的变化特征及其可能的生物学意义.方法用病理学技术检测不同发育时期皮肤的结构特征后,提取18例不同胎龄(13～32周)的胎儿皮肤和6例出生后机体皮肤组织的总RNA后,分离mRNA,用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)方法检测这3种基因在不同组织中的表达变化规律.结果 TGF-β1、smad2和smad3基因在不同发育阶段的皮肤组织中都有表达.在早期妊娠胎儿的皮肤组织中,TGF-β1和smad2基因表达较弱,随着胎龄的增加,皮肤组织内这两种基因表达逐渐增强,在出生后机体的皮肤组织中,这两种基因的表达量分别为妊娠早期皮肤的1.3倍和5.9倍,基因表达显著升高(P<0.05).smad3基因的表达呈不同的变化规律,在妊娠早期的皮肤组织中,该基因的表达较强,随着胎儿的生长发育,该基因表达逐渐降低,而在出生后机体的皮肤组织内,smad3基因表达产物的灰度值又升至0.272±0.022,与早期妊娠胎儿皮肤相比差异不明显(P>0.05).结论 TGF-β1、smad2和smad3基因在不同发育阶段人皮肤组织内都有表达,显示TGF-β1介导的信号通路可能对皮肤的发生、结构功能的维持以及伤后修复十分重要.在早期妊娠胎儿皮肤中,TGF-β1和smad2基因低表达可能是胎儿皮肤创面无瘢痕修复的机制之一,smad3基因在其中的作用还需进一步研究.
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瘢痕疙瘩家系外周血Smad2基因的突变检测
目的 对一瘢痕疙瘩家系进行Smad2基因的突变检测,以明确Smad2基因突变是否与这一家系发病有关.方法 以瘢痕疙瘩家系中4个患者的瘢痕疙瘩组织及其周围正常皮肤、外周血为研究对象,以其配偶的外周血为正常对照,采用PCR及基因序列分析,对所有标本的Smad2基因的所有外显子进行突变检测.结果 基因测序在所有标本中Smad2基因的1～11外显子及其邻近内含子均未发现突变.结论 此瘢痕疙瘩家系的致病基因,可能不是Smad2基因.
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siRNA抑制TGFβ3诱导小鼠腭裂机制的研究
目的:探讨siRNA抑制TGFβ3诱发腭裂的机制.方法:使用不同剂量(200、400、800pmol)经脂质体LipofectamineTM2000包裹的TGFβ3 StealthTMRNAi于交配后(days post coitum,dpc)12天做孕鼠官腔注射,等体积生理盐水注射作为空白对照.14dpc时取部分胎鼠腭突,RT-PCR及Western印迹检测腭突中TGFβ3、Smad2、BMP2的表达情况.16dpc时再取部分胎鼠腭突,观察腭突融合情况,免疫组织化学及免疫荧光观察胚鼠腭突的TGFβ3、Smad2、BMP2的表达情况.实验数据均以SPSS13.0软件包进行分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验.结果:宫腔注射800pmol的StealthTMRNAi,可引起TGFβ3基因mRNA和蛋白表达水平明显降低,400pmol组能显著降低Smad2基因的mRNA和蛋白表达水平,但BMP2的表达情况未受明显影响.20％～60％的实验组小鼠胚胎腭突不能融合,形成腭隐裂,与空白对照组相比,其TGFβ3、Smad2的表达量较低,而BMP2的表达未见显著变化.结论:在12dpc给予小鼠官腔注射TGFβ3 StealthTMRNAi,能有效沉默TGFβ3基因,20％ ～60％小鼠胚胎形成腭隐裂,同时Smad2基因表达下调,但对BMP2基因表达无明显影响.
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Smad2小干扰RNA载体的构建及其沉默效应的鉴定
目的 构建smad2特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并检测肿瘤细胞中其对smad2基因表达的干扰效果.方法 根据smad2基因序列设计合理的smad2 siRNA,并将合成的寡核苷酸序列克隆到pSliencer 2.1-U6 neo载体中,转化大肠杆菌DH5α;挑取阳性菌落进行质粒酶切和序列分析;将构建正确的smad2 siRNA重组质粒转染,或与带Flag标签的smads真核表达载体共同转染293T细胞或HeLa细胞,收集细胞裂解物,Westem印迹检测siRNA的干扰效果.结果 正确构建了smad2 siRNA重组质粒,对smad2表达的特异性干扰效果可达70%以上.结论 成功构建了smad2 siRNA载体,为进一步探讨smad2 在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.
