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改进竞争性RT-PCR法在定量PER1基因表达中的应用
目的研究使用不同样品稀释液及变性高效液相色谱(DHPLC)梯度条件对定量检测PER1基因表达的影响.方法竞争性RT-PCR与DHPLC结合定量检测基因表达.结果样品稀释液中含有载体可极大提高实验的重复性、准确性;不同DHPLC梯度条件对定量结果无明显影响.结论建立定量PER1基因mRNA表达水平的竞争性RT-PCR系统有助于精确检测微量标本中节律基因表达的变化,探寻生物节律与疾病状态间的关系.
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hPer1相互作用蛋白的筛选
目的 应用酵母双杂交系统筛选血液中与人体生物钟蛋白Per1相互作用的新蛋白.方法 以人Per1的basic HLH-PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选与之相互作用的新蛋白.阳性克隆送测序后用生物信息学分析.结果 酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.通过测序和生物信息学分析,其中之一能与Per1相互作用的蛋白为LSMD1.结论 通过酵母双杂交系统证明Per1能够与LSMD1发生相互作用.
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肿瘤细胞节律基因对其药物敏感性的影响
目的 通过体外实验诱导节律基因表达,探讨肿瘤细胞节律基因对其药物敏感性的影响.方法 采用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(PMA)诱导体外培养的EMT6乳腺癌细胞节律基因的表达;在不同时间点,以RT-PCR检测节律基因的代表mPer1基因的表达水平.在mPer1基因表达的高峰与低谷分别给予阿霉素(ADM)处理.采用二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝(MTT)法和流式细胞术检测ADM对EMT6细胞增殖的影响.结果 PMA诱导后,EMT6细胞的mPer1基因呈近日节律.在mPer1基因表达高峰时,ADM对肿瘤细胞的抑制率高于其在低谷的抑制率.结论 肿瘤细胞节律基因能够影响其对药物的敏感性.
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Per1与Per2基因在胆管癌中的表达
目的：分析人类生物钟基因Per1与Per2在人类胆管癌中的表达，研究其表达与人类胆管癌的关系。方法获取人原发胆管癌标本58份，另取距离肿瘤边缘2 cm外组织作为正常对照。采用免疫组织化学方法检测人原发胆管癌标本与正常对照组织中Per1与Per2基因蛋白产物（ Per1、Per2蛋白）的表达。结果58份人原发胆管癌标本与正常对照组织中均见Per 1与Per2蛋白表达，但胆管癌标本中Per1与Per2蛋白的表达较正常对照组织明显下降（ P＜0.05）。结论生物钟基因Per1与Per2蛋白可能与人类胆管癌的发生及发展有关。
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生物钟PER1基因在口腔鳞癌中的昼夜节律变化及与体内肿瘤生长的关系
目的 探讨生物钟PER1基因在口腔鳞癌中的昼夜节律变化情况和与肿瘤体内生长的关系.方法 60只裸鼠置于12 h光照和12 h黑暗交替环境中饲养3周后,将人颊鳞癌BcaCD885细胞接种于裸鼠颊部,建立口腔颊鳞癌模型.3周成瘤后,在24 h内按灯亮后4、10、16、22 h(4 HALO、10 HALO、16 HALO、22 HALO)的4个时间点分别处死15只裸鼠,取出肿瘤,称量,常规切片在HE染色下计算各时间点肿瘤的有丝分裂指数(MI)；分别用S-P免疫组化、Western blot和Real-time RT-PCR检测各时间点癌细胞中PER1蛋白和mRNA的表达；分别用方差分析和余弦分析检验各指标在4个时间点的差异性和是否具有昼夜节律性.结果 颊鳞癌细胞PER1蛋白、PER1 mRNA、肿瘤MI和肿瘤质量在昼夜不同时间点具有显著性差异(P＜0.01),其变化波动具有昼夜节律性特征(P＜0.05)；肿瘤MI和肿瘤质量与PER1的表达水平呈反比关系,PER1 mRNA表达的峰值与肿瘤MI和质量的谷值均位于活动相的中期,而PER1 mRNA表达的谷值与肿瘤MI和质量的峰值均位于休息相中期.结论 口腔鳞癌中PER1的表达、肿瘤MI和质量在昼夜不同时间点的波动具有24 h昼夜节律性规律,PER1在口腔鳞癌中为抑癌基因.
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左旋精氨酸对AR42J细胞节律基因Per1表达的影响
目的:研究左旋精氨酸对大鼠胰腺腺泡细胞(AR42J)节律基因Per1表达的影响.方法:采用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐诱导AR42J细胞节律基因表达.在Per1 RNA表达出现稳定近日节律后,设置实验组与对照组,实验组中加入含L-Arg培养液,对照组加入等量不含L-Arg培养液,采用RT-PCR法检测不同时间点AR42J细胞中Per1 RNA的表达水平.结果:RT-PCR结果显示加入L-Arg实验组的Per1 RNA表达量比对照组明显降低(P＜0.05).结论:L-Arg可引起胰腺腺泡细胞中的Per1 RNA表达降低,提示氨基酸可影响节律基因的表达.
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过表达Gnb2l1基因对体外节律基因mPer1表达的影响
目的:评价过表达Gnb2l1基因对节律基因mPer1表达的影响.方法:用PMA刺激NIH3T3细胞,使节律基因稳定表达后,用脂质体介导方法将质粒pcDNA3.1/Gnb2l1转染至NIH3T3细胞,并以空载体质粒pcDNA3.1/vector为对照.利用RT-PCR技术检测不同时间点Gnb2l1 mPer1在NIH3T3细胞中的表达水平,研究过表达Gnb2l1基因对mPer1基因表达的影响.结果:采用RT-PCR技术显示成功转染,实验组比对照组的Gnb2l1表达量明显增高(p<0.05).并且发现实验组的mPer1表达量比对照组明显增高,但是经过余弦分析发现两组相比mPer1的表达周期无明显改变.结论:成功过表达Gnb2l1基因使节律基因mPer1表达量增加,中值增高(p=0.038).
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细菌双杂交筛选肿瘤细胞中与人生物钟蛋白PER1相互作用的蛋白
目的 筛选肿瘤细胞中与生物钟分子振荡系统的重要组成部分PER1蛋白(period circadian protein homolog 1)相互作用的蛋白质分子,为生物钟基因在肿瘤发生发展过程中的功能研究提供条件.方法 应用细菌双杂交技术与人宫颈癌Hela细胞cDNA文库,以pBT为载体,构建pBT-PER1融合表达诱饵质粒,与pTRG连接的人宫颈癌Hela细胞cDNA文库质粒共转化双杂交系统报告菌株,利用培养基的特殊选择性,筛选出阳性克隆并测序分析.结果 筛选出14个蛋白编码基因,其中4个包含完整的蛋白编码序列,包括与线粒体动力学相关的OPA3蛋白,与铜代谢相关的CUTA蛋白,与细胞运动、定位等细胞事件相关的蛋白,与物质合成、代谢等生物化学反应相关的蛋白,还有在信号转导中发挥作用的相关蛋白.结论 肿瘤细胞中与PER1蛋白存在潜在相互作用新蛋白的筛选和鉴定为研究人生物钟基因PER1在肿瘤发生发展中的功能提供了条件.
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Exendin-4通过拮抗钙超载改善Aβ31-35诱导的HT22海马神经细胞per1基因异常表达
目的:探讨Exendin-4对Aβ31-35所致的HT22神经细胞per1基因异常表达的影响及可能作用机制.方法:本研究采用海马神经细胞HT22作为实验对象.以1％血清饥饿1h来诱导细胞同步化(CT0).MTT实验检测细胞存活率;倒置显微镜下观察细胞形态变化;Rea1-time PCR检测各CT时间per1基因的表达变化;选择per1表达差异显著的CT时间点,采用流式细胞术检测细胞内钙离子浓度的变化情况.结果:(1)Exendin-4可以明显提高Aβ31-35所致的HT22细胞存活率的下降;(2)镜下观察可见,经Exendin-4预处理后部分改善了Aβ31-35对细胞的损伤作用,细胞形态有所恢复;(3)Aβ31-35使per1基因在CT16时各处理组的相对表达量明显不同;与对照组相比,Aβ31-35使per1基因表达量明显升高;经Exendin-4预处理后,per1基因的表达得到一定程度的恢复,差异具有统计学意义;(4)在CT16时各处理组细胞荧光强度值明显不同,与对照组相比,Aβ31-35使细胞荧光强度明显增强;经Exendin-4预处理后,细胞荧光强度值明显降低,差异具有统计学意义,此结果与加入尼莫地平的结果类似.加入尼莫地平预处理后,检测各个CT时间per1基因表达变化,与Exendin-4预处理组得到的结果类似.结论:Exendin-4通过拮抗钙超载改善Aβ31-35诱导的HT22海马神经细胞per1基因的异常表达.
