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人乳头瘤病毒16型转换基因的序列分析
为了解中国地区宫颈癌病人中人乳头瘤病毒16型E6E7基因结构特点, 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取组织DNA, 经HPV多重引物PCR法鉴定标本中感染HPV型别 ,选单纯感染HPV16型两例标本DNA为模板进行PCR扩增,获得HPV16 E6E7基因后, 重组入pALTER-1载体, 进行双向测序、分析.DNA序列分析表明: 两例标本的HPV16 E6E7序列全长均为776bp, 与已发表的德国标准株长度相等, 两例均为变异株,共检出5处核苷酸变异位点,其中4处可导致氨基酸改变.中国山东地区宫颈癌病人中HPV16 E6E7的基因结构与德国标准株的HPV16 E6E7基因之间存在差异.
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稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立
目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系.方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7.利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆.利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达.结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功.结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系.该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础.
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北京地区人乳头瘤病毒16E6E7基因变异和序列分析
目的了解北京地区人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7结构特点,为研制HPV16疫苗奠定基础.方法从HPV感染组织中提取DNA,PCR鉴别其型别,从单独HPV16感染的标本中分离HPV16 E6E7基因,克隆入载体pGEM-3ZF,进行双向测序,与德国标准株进行比较.结果构建了北京地区HPV16 E6E7的重组质粒.测序结果表明该基因全长为776 bp,与已发表的德国标准株长度相等,3处核苷酸发生变异,同源性99.7%.分别位于第60、96和565nt(相当于HPV16全长序列中第142、178和647nt),2处位于E6区,1处位于E7,其对应氨基酸分别为第20、32和188个氨基酸,分别由Pro(CCA)、Asp(GAT)和Asn(AAT)变异为Pro(CCG)、Glu(GAG)和Ser(AGT).结论北京地区HPV 16E6E7基因结构与德国标准株存在差异.
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稳定表达人乳头瘤病毒58型(HPV58)E6E7融合基因的人宫颈癌细胞株C33A的构建及验证
为构建稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的人宫颈癌C33A细胞系,将实验前期构建好并实现真核表达的重组慢病毒颗粒LV-HPV58E6E7转染入HPV(-)的人宫颈癌C33A细胞,经流式细胞仪分选出稳定转染的阳性克隆,利用四唑盐比色(MTT)法检测转染后细胞的生长情况以及流式细胞术检测细胞周期,并将稳定表达HPV58E6E7融合基因的C33A细胞LV-HPV58E6E7/C33A接种于裸鼠左腋下成瘤,用荧光定量PCR (qRT-PCR)、Western blot检测瘤组织中HPV58型E6E7融合基因的转录和表达.结果显示HPV58E6E7融合基因可促进C33A细胞的增殖;LV-HPV58E6E7/C33A细胞株能在裸鼠体内稳定转录及表达HPV58型E6E7融合基因.这表明我们成功建立了能稳定表达HPV58E6E7融合基因的人宫颈癌C33A细胞系LV-HPV58E6E7/C33A,为HPV58型治疗性疫苗的免疫效果检测提供了抗原细胞来源.
关键词： 人乳头瘤病毒58型 E6E7基因 稳定转染 人宫颈癌C33A细胞
