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羧胺三唑抑制大鼠腹腔巨噬细胞iNOS表达和NF-κB活化
目的 探讨羧胺三唑(CAI)对多种炎性相关因子的体外调节作用及机制.方法 利用MTT法观察5～40 μmol/L的CAI对细胞活力的影响.将上述浓度的CAI加入巨噬细胞中共同培养18 h,同时加入脂多糖(LPS)诱导上述细胞活化.分别用硝酸还原法和TNF-α EMSA检测试剂盒测定培养基上清中NO的含量和TNF-α的水平,用Western blot法测定iNOS蛋白的表达和NF-κB活化.结果 浓度在5～40 μmol/L范围内的CAI对正常大鼠腹腔巨噬细胞的细胞活力没有影响,但20和40 μmol/L的CAI能够剂量依赖性地降低LPS诱导的NO释放(P＜0.01和P＜0.001)以及TNF-α分泌(P＜0.05和P＜0.01),且明显抑制LPS引起的iNOS蛋白表达和NF-κBB活化.结论 CAI对与炎件反应相关的调控因子iNOS蛋白表达和NF-κB活化具有抑制作用,该机制与抑制IκBα磷酸化和降解相关.
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四妙勇安汤提取物抑制巨噬细胞NF-κB活化和MMP-9分泌的初步研究
目的 探讨四妙勇安汤提取物对巨噬细胞核转录因子-κB(NF-κB)活化和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)分泌的作用,为开发抗不稳定型心绞痛中药的研发提供基础实验数据.方法 以LPS损伤小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,ELISA法检测上清液中MMP-9的含量;同时,采用NF-κB-RE基因转染细胞,通过荧光素酶检测试剂检测细胞内NF-κB的变化,采用高通量筛选技术筛选出提取物的有效组分.结果 在一定浓度范围内,1、2、3、4、6号提取物能够明显降低LPS作用后MMP-9的分泌,并具有浓度依赖关系;1、2、3、4、6、7号提取物对NF-κB信号通路具有阻断作用.结论 四妙勇安汤部分提取物可抑制LPS刺激后巨噬细胞NF-κB信号通路,同时减轻MMP-9的分泌,这一作用可能与其抗冠心病不稳定心绞痛的作用相关.
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过表达TRPM7蛋白对HEK293细胞氧糖剥夺再氧合损伤后NF-κB活化的影响
目的 探讨过表达瞬时受体电位通道M7(transient receptor potential melastatin type 7 channel,TRPM7)蛋白对人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)氧糖剥夺再氧合(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤后细胞核内核转录因子kappa B(nuclear factor κB,NF-κB)表达水平的影响,并研究上述变化是否通过Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)蛋白介导.方法 运用重组DNA技术建立四环素调控稳定性表达TRPM7的HEK293细胞系(293-TRPM7/WT):加入四环素诱导稳定表达TRPM7的293-TRPM7/WT细胞称为Tet(+)细胞,未加入四环素的293-TRPM7/WT细胞称为Tet(-)细胞.通过免疫印迹技术鉴定上述细胞,予以氧糖剥夺1 h/再氧合24 h处理后,运用免疫印迹技术检测细胞核内NF-κB p65蛋白和TLR4蛋白的表达;在Tet(+)细胞OGD处理前1 h加入TLR4特异性抑制剂TAK242或同体积二甲基亚砜(DMSO),使用免疫印迹技术检测细胞核内NF-κB p65蛋白表达的变化.结果 ① Tet(-)细胞在经过OGD/R处理后,细胞核内NF-κB的表达增加(P<0.05),而Tet(+)细胞在OGD/R后核内NF-κB的表达量与经过同样处理的Tet(-)细胞相比增加更为显著(P<0.05);② Tet(-)细胞在OGD/R损伤后细胞内TLR4的表达升高(P<0.05),与之相比,Tet(+)细胞在OGD/R处理后TLR4的表达量则更为升高(P<0.05);③ Tet(+)细胞经过OGD/R处理,并加入TLR4特异性抑制剂TAK242后,与未加药组或DMSO组相比,细胞核内NF-κB蛋白表达明显下降(均P<0.05).结论 过表达TRPM7增加OGD/R后293-TRPM7/WT细胞内TLR4蛋白的表达,并通过TLR4介导加速OGD/R后NF-κB的活化.
