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siRNA沉默胃癌SGC-7901细胞HO1基因的细胞系的建立及其生物学行为
目的 构建HO1基因的真核干扰表达载体,评估其转染人胃癌细胞系SGC-7901细胞后对HO1基因的干扰效果及其功能.方法 将外源性重组真核干扰表达载体HO1基因(pS/HO1)转染到人胃癌细胞系SGC-7901内,经G418筛选并建立siRNA表达载体稳定沉默胃癌SGC-7901细胞HO1基因的细胞系,分为SGC-7901-pS/HO1组,转染空质粒细胞(SGC-7901-pS)组和未处理细胞(SGC-7901)组；用实时荧光定量PCR和蛋白印迹验证HO1基因在各组细胞中的表达,并通过CCK-8和克隆形成实验分别观察HO1基因被干扰后细胞的生物学行为.结果 与SGC-7901-pS组相比,SGC-7901-pS/HO1细胞中HO1基因蛋白表达明显减少,降低了5.58倍(0.321±0.051 vs 1.675±0.153,P＜0.05)；与对照组相比较,SGC-7901-pS/HO1实验组较SGC-7901-pS对照组细胞增殖数量明显减少(P＜0.001)；与转染pS空载体的SGC-7901-pS细胞对照组相比,SGC-7901-pS/HO1细胞的克隆形成明显减少,降低了3.45倍(8.32±1.142 vs 2.32 ±0.362,P＜0.05).结论 HO1基因真核siRNA表达载体筛选成功,为继续深入的研究HO1基因在胃癌中的功能提供了依据.
关键词： 胃癌 HO1基因 干扰载体 SGC-7901细胞 -
FoxO1基因对Jurkat细胞FoxO1-KLF2-S1P1通路的调节作用
目的:通过构建FoxO1表达和干扰慢病毒载体,建立细胞内FoxO1-KLF2-S1P1信号通路调控研究模型,观察FoxO1过表达、干扰表达在Jurkat细胞内对其下游分子表达及功能的影响.方法:构建FoxO1表达和干扰表达慢病毒载体,分别感染Jurkat细胞,采用荧光定量PCR、Western blot和流式细胞术检测S1P1、CD62L、CCR7、CD69 mRNA水平和蛋白分子的表达.结果:FoxO1过表达组于感染后120 h FoxO1、KLF2、S1P1和CD62L mRNA水平显著增高(P<0.05),FoxO1、FoxO1-p和KLF2胞浆蛋白水平增高,S1P1+细胞和CD62L+细胞比率增高(P<0.05),CCR7+细胞和CD69+细胞未见显著改变(P>0.05).FoxO1干扰组于转染后120 h FoxO1、KLF2、S1P1和CD62L mRNA水平降低(P<0.05),FoxO1、FoxO1-p和KLF2胞浆蛋白水平低于对照组,S1P1+细胞百分比增多(P<0.05),但S1P1+细胞和CD62L+细胞在72 h时减少(P<0.05).结论:FoxO1表达和干扰慢病毒载体转染Jurkat细胞并调节KLF2、S1P1和CD62L等分子的表达,为开展细胞内FoxO1-KLF2-S1P1信号通路调控和细胞相关功能的研究打下了基础.
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核转录因子κB抑制子α、β和ε共同稳定下调的HepG2细胞系的建立
目的:利用RNA干扰的方法,构建针对人核转录因子κB抑制子(IκB)α、β和ε的共同干扰载体,转染人肝细胞癌HepG2细胞,建立稳定、共同下调IκBα、IκBβ和IκBε的HepG2细胞系,为后续研究奠定基础.方法:构建3个针对人IκBα基因的干扰载体pcDNATM6.2-miR-IκBα(1,2,3),转染HepG2细胞,在mRNA和蛋白水平检测3个干扰载体对IκBα表达的抑制作用,筛选出抑制效果好的干扰载体.以同样的方法构建并筛选出分别针对人IκBβ和IκBε基因的佳干扰载体,通过酶切连接反应将分别针对IκBα、IκBβ和IκBε基因的3个佳干扰片段串联连入pcDNATM6.2-miR干扰载体中,构建可同时干扰IκBα、IκBβ和IκBε的共同干扰载体pcDNATM6.2-miR-IκBα-IκBβ-IκBε.将共同干扰载体转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立IκBα、IκBβ和IκBε的表达共同稳定下调的HepG2细胞系,并以蛋白质印迹法检测IκBα、IκBβ和IκBε的蛋白表达.结果:成功构建共同干扰载体pcDNATM6.2-miR-IκBα-IκBβ-IκBε;Western印迹结果显示,与正常及对照载体pcDNATM6.2-miR-Neg转染的HepG2细胞相比,在稳定转染pcDNATM6.2-miR-IκBα-IκBβ-IκBε的HepG2细胞系中,IκBα、IκBβ和IκBε的表达均稳定下调.结论:成功建立了IκBα、IκBβ和IκBε共同稳定下调的人肝细胞癌HepG2细胞系,为后续研究奠定了基础.
关键词： 核转录因子κB抑制子 RNA干扰 HepG2细胞 干扰载体 -
蛋白激酶C受体1过表达载体、干扰载体的构建及鉴定
目的：构建并鉴定蛋白激酶C受体1（ RACK1）过表达及干扰真核表达载体。方法采用逆转录聚合酶链反应（ RT-PCR）从人肝癌细胞系Huh-7．5．1中扩增RACK1全长cDNA系列，用巢式PCR扩增对应的CDS，并将其克隆到PIRES2-EGFP，PCR鉴定后进行测序分析。以人RACK1基因为靶基因，设计合成两对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列，退火后与酶切后的载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen进行连接，并行酶切分析和测序鉴定。将构建好的过表达载体和干扰载体用脂质体转染HUVEC细胞系。结果两对引物PCR扩增的序列大小与预期结果一致，PIRES2-EGFP/RACK1载体954个碱基成功插入到预计位点，序列完全一致。 RNA干扰载体pRetroQ/RACK1-1、pRetroQ/RACK1-2和pRetroQ/HK插入序列均与预计相符。荧光显微镜观察，转染的HUVEC细胞均表达EGFP和GFP。结论成功构建RACK1过表达载体及其RNA干扰载体，并可被成功导入HU-VEC细胞系。
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SAA在鼻咽癌CNE-2细胞中的表达及其对细胞生长、凋亡的影响
目的 观察血清淀粉样蛋白A(SAA)在鼻咽癌CNE-2细胞中的表达及其对细胞生长、凋亡的影响.方法 构建针对SAA基因的shRNA表达干扰载体,筛选出有效的小干扰RNA(siRNA)序列,利用siRNA技术和高表达载体分别沉默及过表达SAA,检测SAA表达对鼻咽癌CNE-2细胞的生长及凋亡的影响.结果 pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482和pCD3.1(+)-SAA在鼻咽癌CNE-2细胞中可有效地沉默及过表达SAA基因的mRNA和蛋白,且与对照组比较差异具有统计学意义(P均＜0.05);SAA增高可促进鼻咽癌CNE-2细胞生长,降低可促进鼻咽癌CNE-2细胞凋亡.结论 在SAA基因的shRNA表达干扰载体中,只有pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482可有效沉默SAA在鼻咽癌CNE-2细胞中的表达;SAA增高可促进鼻咽癌CNE-2细胞生长,SAA沉默可促进鼻咽癌CNE-2细胞凋亡.
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人NHE-1基因miRNA干扰载体构建、鉴定及干扰效应评价
目的构建人钠氢交换蛋白-1（NHE-1）基因的miRNA特异性干扰表达载体并转染293细胞,筛选其有效性。方法设计4对miRNA oligo,依次通过退火、连接,构建含NHE-1前体miRNA的重组干扰质粒pcDNATM 6.2-GW/NHE-miR和阴性对照质粒pcDNATM 6.2-GW/neg-miR,并转染293细胞,经Re-al-Time PCR评价干扰效应,筛选出干扰效应佳的靶序列。结果测序证实目的片段正确插入载体中,成功构建4个人NHE-1基因miRNA干扰载体;Real-Time PCR证实完成干扰效应评价,并根据NHE-1基因转录调控区及其蛋白分子结构功能区评价结果,得到NHE1-4是佳干扰片段。结论成功构建针对人NHE-1基因的miRNA特异性有效干扰质粒,为后续NHE-1基因腺病毒miRNA表达载体的构建及其在调控APP裂解相关酶类的功能研究奠定了基础。
