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经典型蛋白激酶Cγ对突触蛋白-Ⅰ磷酸化调节及其在脑缺血损伤中的作用
目的 探讨经典型蛋白激酶Cγ(cPKCγ)对突触蛋白-Ⅰ磷酸化水平的影响及其在小鼠原代脑皮层神经元氧-糖剥夺(OGD)缺血损伤中作用.方法 借助cPKCγ基因敲除(cPKCγ-/-)小鼠,利用小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)在体缺血模型和原代脑皮层神经元OGD离体细胞缺血模型,采用免疫共沉淀(Co-IP)、蛋白免疫印迹和免疫荧光等生物化学技术,验证cPKCγ与突触蛋白-Ⅰ的相互作用,探讨cPKCγ对突触蛋白-Ⅰ磷酸化水平的调节及小鼠原代脑皮层神经元OGD损伤后对神经元形态的影响.结果 免疫共沉淀结果证明,正常及缺血小鼠脑皮层组织中cPKCγ与突触蛋白-Ⅰ均存在相互作用;对突触蛋白-Ⅰ 5个可能的丝氨酸磷酸化位点进行筛选发现,只有Ser549和Ser553位点的磷酸化水平在OGD和cPKCγ敲除前后有明显变化;进一步统计分析得出,野生型(cPKCγ+/+)小鼠原代脑皮层神经元中,OGD处理使突触蛋白-Ⅰ Ser549和Ser553位点的磷酸化水平显著降低(每组n=5,与野生型常氧组相比P＜0.05),cPKCγ基因敲除可显著降低上述两个位点的磷酸化水平(每组n=5,与野生型常氧组相比P ＜0.05),而OGD处理后降低趋势更明显(每组n=5,与野生型OGD组相比P＜0.05);除此之外,OGD处理可使cPKCγ+/+和cPKCγ-/-脑皮层神经元突起的长度和数目均显著降低(每组n=8,与野生型常氧组相比,P＜0.05),cPKCγ-/-组降低现象更加显著(每组n=8,与野生型OGD组相比,P＜0.05).结论 缺血/低氧损伤情况下,cPKCγ可能通过调节突触蛋白-Ⅰ Ser549和Ser553磷酸化水平影响神经元突起的形态,从而保护神经元免受缺血/低氧损伤.
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突触蛋白-Ⅰ在胚胎干细胞体外神经分化过程中的表达变化
目的 探讨突触蛋白-Ⅰ(synapsin-Ⅰ)在胚胎干细胞(ESCs)体外神经分化过程中的表达变化及作用.方法 采用"五步法"和维甲酸(RA)法两种途径体外诱导ESCs向神经细胞分化,并以另一种可向神经细胞分化的肿瘤细胞-PC12细胞的诱导过程作参照,从不同的途径、不同的细胞进行比较,通过免疫组织化学、RT-PCR、Westernblot方法观察这一过程中synapsin-Ⅰ的表达变化,找出synapsin-Ⅰ在ESCs向神经细胞分化过程中表达变化的共同规律.结果 结合形态学和其它神经特异性指标的变化,synapsin-Ⅰ在ESCs和PC12细胞向神经细胞分化的过程中具有早期即有表达,后逐渐升高,至分化成熟阶段达高,后期又逐渐下降的变化规律.结论 在ESCs的分化过程中,synapsin-Ⅰ的表达存在特定的时空规律,并与ESCs的形态学改变相关,提示synapsjn-Ⅰ可能对ESCs在神经分化过程中的形态分化起着重要的作用.
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大鼠海马发育过程中突触蛋白-Ⅰ和生长相关蛋白-43 mRNA的表达
目的:探讨大鼠海马突触蛋白和生长相关蛋白-43 mRNA的表达,了解神经元的发育.方法:采用RT-PCR方法检测大鼠发育不同阶段突触蛋白和生长相关蛋白-43 mRNA量的变化.结果:RT-PCR产物电泳后在731 bp、984 bp、324 bp处出现清晰的电泳条带,实际扩增长度与设计长度相吻合,未出现与DNA相同的杂带.内参照β-actin的PCR产物电泳条带在孕期、新生和成年时亮度均一.突触蛋白的PCR产物电泳条带以成年大鼠表达强,胎鼠次之,新生大鼠较弱.生长相关蛋白-43的PCR产物电泳条带以新生鼠亮度强,胎鼠次之,成年大鼠暗.结论:大鼠海马在新生期处在轴突生长旺盛的时期,而在胚胎期和成年期是突触形成和建立的主要阶段.
