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寨卡病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与应用
本研究建立了一种简单、快速、准确的寨卡病毒可视化逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法.在线设计3套LAMP引物,利用实时浊度仪筛选佳引物,加入羟基萘酚蓝,评估可视化RT-LAMP检测方法的灵敏度和特异性.建立的可视化RT-LAMP方法可检测的低浓度为101 copies/μL,高于普通PCR和荧光定量PCR 1~2个数量级;同时,该方法不与其他虫媒病毒产生交叉反应.该方法可为虫媒监测和临床诊断提供实验依据.
关键词： 寨卡病毒 逆转录环介导等温扩增 可视化检测 羟基萘酚蓝 -
环介导等温扩增技术快速检测HPV18方法的建立
目的 应用环介导等温扩增技术(LAMP)对人乳头瘤病毒18(HPV18)进行基因检测,建立一种快速、可视的HPV18核酸检测方法.方法 针对HPV18病毒特异性E6区设计LAMP检测引物,通过调整反应物浓度建立LAMP反应体系,用羟基萘酚蓝(HNB)染料对产物进行可视化判定.通过检测其他不同基因型别的病毒评估引物特异性,检测倍比稀释的临床标本确定其灵敏度,通过LAMP法检测临床标本验证其与PCR法的一致性.结果 利用LAMP方法检测到HPV18病毒E6引物的特异性好,恒温65℃条件下反应60 min即可较好完成检测.LAMP特异性好,灵敏度高,灵敏度为2.5×103拷贝/ml.LAMP可视化结果判定与PCR凝胶电泳结果相当,二者有较好的一致性(P＞0.05).结论 建立了HPV18病毒的LAMP快速、可视化检测方法,该法操作简便快捷,具有很好的开发应用前景.
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可视化环介导等温扩增技术在肺炎支原体检测中的应用
目的 建立可视化肺炎支原体环介导等温扩增(LAMP)检测体系,并对其敏感性和特异性进行验证,以期开发出适合各级医院和现场高通量检测的肺炎支原体试剂盒.方法 克隆肺炎支原体P1基因质粒,并以此为模板建立LAMP体系,优化肺炎支原体LAMP体系的各组分和反应参数,添加反应指示剂羟基萘酚蓝,用已知浓度的肺炎支原体P1质粒检测体系敏感性;以相近种类支原体和细菌检测体系特异性.结果 建立的可视化肺炎支原体LAMP体系能特异性检测肺炎支原体,检测限为2×102 copies/mL.结论 建立的可视化肺炎支原体LAMP检测体系可应用于人肺炎支原体检测,价格低廉,无需贵重仪器设备,操作简便,适合各级医院和现场高通量肺炎支原体检测.
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肠出血性大肠杆菌O157∶H7的快速可视化检测
目的 应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术和羟基萘酚蓝(Hydroxynaphtholblue,HNB)指示剂建立肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157∶H7快速可视化检测方法.方法 针对EHEC O157∶H7脂多糖编码基因rfbE保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料HNB作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,并评价检测方法的特异性和灵敏度.结果 本方法低检出限约为100拷贝/反应管,高于普通PCR;检测特异性高,仅EHEC O157∶H7反应管HNB颜色由紫罗兰变成天蓝色,而肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均不发生变色反应；体系的扩增效率高于普通PCR,40 min内出结果.结论 建立的基于颜色判定的EHEC O157∶H7 LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于EHEC O157∶H7现场快速检测.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 可视化检测 环介导等温扩增 羟基萘酚蓝 -
应用环介导等温扩增技术可视化检测乙型肝炎病毒
目的 建立利用煮沸血清可视化检测乙型肝炎病毒(HBV)的环介导等温扩增技术(LAMP)方法. 方法 根据GenBank上提交的HBV的S基因序列比对后的相对保守区设计特异LAMP引物,分别用试剂盒法和煮沸法提取样本DNA.对反应条件进行优化,通过检测HBV标准毒株和临床样本来评价LAMP的特异性、灵敏度和抗干扰性,将实验结果和PCR进行比较.同时,对LAMP实验结果进行可视化检测.应用SPSS17.0软件进行一致性检验. 结果 建立了适LAMP反应条件,LAMP特异性高,没有产生非特异性扩增.无论使用哪种核酸提取方法,LAMP灵敏度均为10拷贝/管.染料羟基萘芬兰(HNB)的灵敏度和电泳检测、SYBR Green Ⅰ效果相当,而不似染料SYBR Green Ⅰ容易造成气溶胶污染.另外,以荧光定量PCR (FQ-PCR)为金标准,煮沸法的LAMP和FQ-PCR具有的一致性较好(Kappa=0.762,P＞0.05).然而,煮沸法的PCR和FQ-PCR的一致性较差(Kappa=0.186,P＜0.05). 结论 LAMP在检测HBV感染中有优于PCR的特点,利用LAMP技术有利于在现场或基层医院检测HBV.
