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基于颜色判定的RT-LAMP技术检测HCoV-OC43冠状病毒
目的 建立基于颜色判定的适用于国境口岸简便、快速、灵敏和特异的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法检测人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)核酸.方法 通过序列比对,选择HCoV-OC43(GenBank号:KU131570)为参考株,根据其核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白基因保守区序列设计6条特异性引物,在65℃等温条件下扩增45 min.在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂,以终反应颜色变化作为结果判断标准.对病毒核酸依次倍比稀释以检验该方法的灵敏性;同时,对甲型、乙型流感病毒和其他HCoV进行检测,以检验该方法的特异性.结果 通过引物筛选终选定了1组特异性引物,仅能与HCoV-OC43病毒核酸产生特异性反应并出现颜色改变,而与其他病毒均不能产生颜色变化,具有较高的特异性.与常规荧光定量RT-PCR法相比,该方法检测灵敏度达5.6拷贝/反应,灵敏度更高,且在短时间内达到对HCoV-OC43基因快速检测的目的.结论 建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法可实现对HCoV-OC43病毒快速、灵敏、特异性检测,具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力.
关键词： 人冠状病毒 逆转录环介导等温扩增 可视化检测 -
寸口桡动脉三维运动的超声可视化检测
以压力仿生柔性传感器与B超探头耦合的中医取脉装置,采集人体寸口桡动脉信号,以脉象位、数、形、势4种属性为纲,同步分析压力脉搏波与超声脉管动态变化趋势图的各项检测指标,以心电图标记法,桡动脉脉搏波的时间同步化分析,进行脉象数字化的理论探讨,并为脉象的4种属性确定积分值.
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利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型
为直接根据颜色变化进行可视化检测H1亚型、N1亚型、N2亚型禽流感病毒(AIV),根据环介导等温扩增技术(LAMP),建立针对H1亚型AIV及特异性鉴定N1、N2亚型的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法.根据GenBank中的AIV基因序列,设计了三套分别针对H1亚型AIV-HA基因及N1、N2亚型AIV-NA基因的特异性简并引物,并优化反应条件和体系.结果表明建立的检测方法对其它亚型AIV及禽呼吸道病原体无交叉扩增反应并能特异性地检测N1、N2亚型AIV,灵敏度优于传统的RT-PCR方法.整个反应在常规水浴中50min就可完成,反应结束后不需打开反应管盖,可根据反应液的颜色变化对结果直接进行判定.120份临床样品用建立的RT-LAMP方法检测到14份H1N1亚型AIV、8份H1N2亚型AIV,结果与病毒分离结果相符.本研究建立的三种RT-LAMP可视化检测技术特异、灵敏、快速、操作和结果判定简便,适合在基层进行H1亚型AIV的快速检测及N1、N2亚型AIV的分型.
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寨卡病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与应用
本研究建立了一种简单、快速、准确的寨卡病毒可视化逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法.在线设计3套LAMP引物,利用实时浊度仪筛选佳引物,加入羟基萘酚蓝,评估可视化RT-LAMP检测方法的灵敏度和特异性.建立的可视化RT-LAMP方法可检测的低浓度为101 copies/μL,高于普通PCR和荧光定量PCR 1~2个数量级;同时,该方法不与其他虫媒病毒产生交叉反应.该方法可为虫媒监测和临床诊断提供实验依据.
关键词： 寨卡病毒 逆转录环介导等温扩增 可视化检测 羟基萘酚蓝 -
大肠埃希菌O157∶H7环介导等温扩增可视化检测方法的建立
目的 建立肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导等温扩增(LAMP)可视化快速检测方法. 方法 针对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7编码脂多糖rfbE基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,评价LAMP方法的特异性和灵敏性. 结果 建立的LAMP法对O157∶H7 rfbE基因的低检出限约为100 copy/反应管,检测肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均为阴性.体系的扩增效率较高,可在40 min内出结果. 结论 建立的基于颜色判定的EHEC O157∶H7 LAMP检测方法具有特异、灵敏,设备要求简单等特点,适用于EHEC O157∶H7的快速检测.
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新型布尼亚病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立
目的 应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立新型布尼亚病毒(SFTSV)可视化快速检测方法. 方法 针对新型布尼亚病毒的S片段基因设计LAMP引物建立LAMP方法.反应体系内加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应扩增指示剂,根据LAMP浊度仪扩增结果优化反应条件,根据HNB颜色变化进行结果判定,评估LAMP方法的特异性和灵敏性. 结果 建立的LAMP方法低检出限为10拷贝/反应管;方法的特异性高,仅SFTSV反应管颜色由紫罗兰变为天蓝色,而汉坦病毒、新疆出血热、Q热、马尔堡、埃博拉病毒及阴性对照反应管均未发生变色反应;LAMP反应的佳温度为63 ℃,其扩增效率高于常规PCR,试验过程仅需30 min. 结论 建立的可视化SFTSV LAMP检测方法具有特异性强,灵敏性高,实验设备要求简单等优点,可用于SFTSV的快速检测.
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克里米亚-刚果出血热病毒可视化逆转录环介导等温扩增快速检测法的建立
目的 建立克里米亚刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)的可视化逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RTLAMP)快速检测法.方法 体外合成CCHFV的S基因,构建重组质粒,体外转录为模板RNA,在线设计3组LAMP引物,使用实时浊度仪筛选出佳引物,以羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue,HNB)作为指示剂,建立可视化RT-LAMP反应体系.结果 实时浊度检测结果显示合成的3组LAMP引物中第1组引物的扩增效率高,峰值出现于20 min.添加环引物后,扩增效率进一步提高,13 min即可达到峰值.利用佳引物建立的CCHFV可视化RT-LAMP检测法低检测限浓度为10拷贝/μl,检出时间为30 min,较巢式RT-PCR法和实时定量RT-PCR法分别高1-3个数量级.该方法稳定性好,不会与症状相近的病原体如肾综合征出血热汉坦病毒(汉滩型和汉城型)、马尔堡病毒、新型布尼亚病毒、埃博拉病毒(GP蛋白和VP蛋白)产生交叉反应.结论 建立的CCHFV可视化RT-LAMP检测法,灵敏度好、特异度高、快速廉价、操作简单,无需开盖即可直接观察结果,适用于条件有限的基层单位和偏远地区.但仍需临床样本进行进一步验证.
关键词： 克里米亚-刚果出血热 逆转录环介导等温扩增 可视化检测 -
基于核酸侵入反应的基因突变检测方法研究进展
肿瘤靶向药物治疗需要检测特异性的基因突变.尽管已开发出多种基于模板扩增的基因突变检测方法,但由于存在扩增产物交叉污染的风险,其应用受到极大限制.基于信号扩增的核酸侵入反应,由于不存在扩增产物污染的风险,并且具有良好的单碱基识别特异性,非常适用于基因突变的检测.因此,一系列基于核酸侵入反应的基因突变检测方法应运而生.综述若干基于核酸侵入反应的基因突变检测方法原理与应用研究.
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肠出血性大肠杆菌O157∶H7的快速可视化检测
目的 应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术和羟基萘酚蓝(Hydroxynaphtholblue,HNB)指示剂建立肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157∶H7快速可视化检测方法.方法 针对EHEC O157∶H7脂多糖编码基因rfbE保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料HNB作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,并评价检测方法的特异性和灵敏度.结果 本方法低检出限约为100拷贝/反应管,高于普通PCR;检测特异性高,仅EHEC O157∶H7反应管HNB颜色由紫罗兰变成天蓝色,而肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均不发生变色反应；体系的扩增效率高于普通PCR,40 min内出结果.结论 建立的基于颜色判定的EHEC O157∶H7 LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于EHEC O157∶H7现场快速检测.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 可视化检测 环介导等温扩增 羟基萘酚蓝 -
输血及细胞治疗的可视化评价技术研究
输血医学已正式成为我国临床医学二级学科,对输血医学科研能力和水平提出了更高的要求,输血医学科研工作已成为输血医学学科发展的内在动力.近年来我国输血科研工作取得了显著的成绩,但与其他学科相比,还有一定的差距.如何培育输血医学新的增长点是广大输血医学科研工作者需要思考的问题.当今生命科学研究从以免疫学、分子生物学为主导的经典科学向前沿学科、高新技术相交叉融合的方向拓展,可视医学、大数据、云计算等已开始应用于生命科学研究领域,也将加速推进输血医学科学研究取得新进展.
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SARS冠状病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立
目的 应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立SARS冠状病毒可视化快速检测方法.方法 针对SARS冠状病毒RNA聚合酶编码基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入钙黄绿素作为LAMP扩增反应指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据钙黄绿素的颜色变化进行结果判定,评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性.结果 本方法低检出限约为10拷贝/反应管,高于普通PCR;检测特异性高,仅SARS冠状病毒反应管钙黄绿素颜色由褐色变为黄绿色,而甲型H1N1病毒、高致病性H5亚型禽流感病毒、普通流感病毒均不发生变色反应；体系的扩增效率高于普通PCR,35 min内出结果.结论 所建立的基于颜色判定的SARS病毒检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于SARS冠状病毒现场快速检测.
关键词： SARS病毒 可视化检测 环介导等温扩增(LAMP) 钙黄绿素 -
环介导等温扩增快速可视化检测B族链球菌的应用研究
目的 建立环介导等温扩增(LAMP)快速检测B族链球菌(GBS)的方法并探讨此方法在临床诊断中的应用价值.方法 培养GBS,提取病原体DNA,设计GBS 16S-23S rRNA基因间隔区LAMP引物,优化并建立LAMP检测GBS的方法.分析LAMP法检测GBS DNA灵敏度,并与聚合酶链反应(PCR)法进行对比.分析LAMP法检测GBS DNA的特异度.结果 LAMP法可在1h内实现GBS DNA的可视化检测,检测限为20 fg,灵敏度高于PCR法(200 fg).LAMP法检测50例经PCR法确诊的GBS感染的临床样本,结果均为阳性,凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌、淋病奈瑟菌、白色念珠菌的检测结果均为阴性.结论 LAMP检测GBS快速、简便、灵敏高且特异度强,检测不需任何设备,借助荧光笔肉眼直接判读,有望成为社区及基层医院广泛开展的新方法.
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应用环介导等温扩增技术可视化检测乙型肝炎病毒
目的 建立利用煮沸血清可视化检测乙型肝炎病毒(HBV)的环介导等温扩增技术(LAMP)方法. 方法 根据GenBank上提交的HBV的S基因序列比对后的相对保守区设计特异LAMP引物,分别用试剂盒法和煮沸法提取样本DNA.对反应条件进行优化,通过检测HBV标准毒株和临床样本来评价LAMP的特异性、灵敏度和抗干扰性,将实验结果和PCR进行比较.同时,对LAMP实验结果进行可视化检测.应用SPSS17.0软件进行一致性检验. 结果 建立了适LAMP反应条件,LAMP特异性高,没有产生非特异性扩增.无论使用哪种核酸提取方法,LAMP灵敏度均为10拷贝/管.染料羟基萘芬兰(HNB)的灵敏度和电泳检测、SYBR Green Ⅰ效果相当,而不似染料SYBR Green Ⅰ容易造成气溶胶污染.另外,以荧光定量PCR (FQ-PCR)为金标准,煮沸法的LAMP和FQ-PCR具有的一致性较好(Kappa=0.762,P＞0.05).然而,煮沸法的PCR和FQ-PCR的一致性较差(Kappa=0.186,P＜0.05). 结论 LAMP在检测HBV感染中有优于PCR的特点,利用LAMP技术有利于在现场或基层医院检测HBV.
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环介导等温扩增技术可视化检测结核分枝杆菌
为了提升对结核分枝杆菌(MTB)检测的实用性,本文开展了采用环介导等温扩增方法(LAMP)对MTB进行可视化检测的研究.首先,根据MTB 16S rDNA序列设计LAMP引物.然后,收集临床痰液样本并进行相应处理.为了评价LAMP的特异度和灵敏度,本文用电泳产物进行检测并用钙黄绿素进行可视化验证.后,以细菌培养结果为金标准,用SPSS 17.0软件比较培养结果与LAMP的一致性.结果显示,特异度实验中无非特异扩增现象,灵敏度实验中的检测极限为10拷贝.另外,可视化产物检测方法和电泳后的灵敏性相一致.进一步进行临床实用性评价,灵敏性为94.47％,特异性为90％,与细菌培养无统计学差异,结果一致性较好(P＞0.05).综上,LAMP技术高效而可视,具有在设备匮乏的现场和基层医疗机构的应用前景.
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微孔板生物芯片测定蜂蜜中四环素残留方法的研究及应用
目的:采用微孔板生物芯片可视化分析技术建立一种内标法蛋白免疫分析新方法,实现单孔内测定蜂蜜中四环素的残留定量.方法:研究中根据间接竞争法反应原理,将四环素人工抗原和纳米银标记的羊抗兔IgG以微阵列形式固定于微孔板底部,制备成微孔板生物芯片阵列,并依次与四环素单克隆抗体、纳米银标记羊抗鼠IgG反应,后用纳米增强法显色,并采用可视化芯片扫描仪对微孔板显色结果进行快速扫描成像,图像采用相关软件处理.结果:该法的检测限可达0.8 ng· mL-1,线性范围为0.8～ 19.2 ng·mL-1,R2 =0.971,回收率达80％ ～ 120％,RSD＜ 10％.结论:本法简便快速,易操作,高通量,能满足日常大规模样品的初筛.
