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温州市食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7污染状况调查
目的 调查温州市食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的污染状况,了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7毒力因子的携带与耐药情况.方法 采用分层随机抽样的方法,对2008-2011年抽取的231份食品样品,用免疫磁珠富集法对大肠杆菌O157∶H7进行分离,对该分离株进行生化、血清学鉴定,以纸片法(K-B法)进行药敏试验;采用PCR方法检测O、H抗原基因和stx1、stx2、eaeA、hlyA等4种毒力基因.结果 231份样品中,分离出1株肠出血性大肠杆菌O157∶H7,检出率为0.43％;O157抗原和H7抗原的核酸检测结果阳性,但未检测到stx1、stx2、eaeA、hlyA等4种毒力基因,菌株对红霉素、利福平、150μg/片和10 μg/片两种浓度的0/129(二氨基二异丙基喋啶磷酸盐)耐药.结论 温州市食品中存在大肠杆菌O157∶H7的污染,检出率较低,但提示要加强主动监测,通过有效干预,防范肠出血性大肠杆菌O157∶H7所致食源性疾病的发生.
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嗜酸乳杆菌对链霉素处理小鼠感染大肠杆菌O157∶H7的预防和治疗作用的观察
目的观察嗜酸乳杆菌对小鼠感染大肠杆菌O157∶H7的可能治疗作用. 方法使用口服链霉素处理的BALB/c小鼠为模型,在大肠杆菌O157∶H7 88-2364感染前或后,在不同时间经口给以嗜酸乳杆菌LAI,观察试验小鼠的临床症状、肠道和肾脏的病理改变、排菌时间以及粪便中志贺毒素对Vero细胞的毒性作用等. 结果发现口服嗜酸乳杆菌可以明显降低感染了大肠杆菌 O157∶H7小鼠的死亡率,降低通过粪便排泄病原菌的时间,以及降低粪便标本对Vero细胞的毒性作用. 结论口服嗜酸乳杆菌对感染大肠杆菌O157∶H7的小鼠有预防和治疗作用.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 嗜酸乳杆菌 志贺毒素 -
上海市由腹泻综合监测系统发现的1例O157∶H7感染性腹泻病例的确认及流行病学调查
目的 分析上海市首例由腹泻综合监测系统报告的肠出血性大肠杆菌(E.coli)O157∶H7感染性腹泻病例的发现过程及流行病学特征,为防制O157∶H7感染提供依据.方法 收集病例的流行病调查资料及临床病史,结合实验室检查结果和历史监测数据进行描述性分析.结果 2013-2015年上海市腹泻综合监测点累计采样8 441例,未检出肠出血性大肠杆菌.2016年6月首次由腹泻患者粪便标本中,检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7产毒株,采集密切接触者共8份粪便标本和环节样本3份,均未检出O157∶H7.结论 本起E.coli O157∶H7感染散发疫情由腹泻综合监测系统发现,应强化腹泻综合监测系统的作用,及时发现传染源,有效控制肠道传染病传播风险.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 流行病学调查 腹泻综合监测 -
2003-2012年中国肠出血性大肠杆菌O157∶H7病原微生物学文献计量学分析
目的:从文献计量学的角度分析2003-2012年间国内肠出血性大肠杆菌O157 ∶ H7的病原微生物学研究状况.方法:利用中国科学引文数据库为统计源,检索2003-2012年国内肠出血性大肠杆菌O157∶H7病原微生物学工作的研究文献,利用文献计量学方法进行统计分析.结果:在中国科学引文数据库中共收集关于肠出血性大肠杆菌O157∶H7病原微生物学研究工作相关文献279篇,其年度间变化呈逐渐上升趋势,《中华微生物学和免疫学杂志》、《中国人兽共患病学报》是刊载此类文献数量较多的期刊,张雪寒和宋宏新是报道相关文献多的专家,《2001年中国食源性致病菌及其耐药性主动监测研究》为单篇被引频次高的文献,所有研究中基因技术研究多,肠出血性大肠杆菌O157 ∶ H7的免疫学研究也占有较大比例.结论:肠出血性大肠杆菌O157∶H7基因技术和免疫学研究工作是相关科研工作者研究的重点.
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肠出血性大肠杆菌O157∶H7的快速可视化检测
目的 应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术和羟基萘酚蓝(Hydroxynaphtholblue,HNB)指示剂建立肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157∶H7快速可视化检测方法.方法 针对EHEC O157∶H7脂多糖编码基因rfbE保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料HNB作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,并评价检测方法的特异性和灵敏度.结果 本方法低检出限约为100拷贝/反应管,高于普通PCR;检测特异性高,仅EHEC O157∶H7反应管HNB颜色由紫罗兰变成天蓝色,而肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均不发生变色反应；体系的扩增效率高于普通PCR,40 min内出结果.结论 建立的基于颜色判定的EHEC O157∶H7 LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于EHEC O157∶H7现场快速检测.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 可视化检测 环介导等温扩增 羟基萘酚蓝 -
大肠杆菌O157∶H7实验感染动物排菌动态检测
目的 检验大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染动物排菌中的应用效果.方法 将牛和小鼠采用灌胃攻毒方式实验感染大肠杆菌O157∶H7,用大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条与细菌鉴别培养基分别培养检测感染动物粪便中的O157∶H7的排菌量和持续时间.结果 牛在感染大肠杆菌O157∶H7后的第2天开始从粪便排菌,第4～6天达到峰值,排菌时间可持续28 d；小鼠在感染O157∶H7后的第4小时开始从粪便排菌,第6小时达到峰值,排菌时间可持续15 d.结论 大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条与细菌鉴别培养基培养计数的检测结果一致,试纸条更简便、快捷、直观,在1 ～5 min内可得出检测结果.
关键词： 胶体金免疫层析检测试纸条 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 牛 鼠 粪便 检测 -
肠出血性大肠杆菌效应因子z2151的E3泛素连接酶活性鉴定
目的 利用基因工程方法原核表达z2151蛋白,并鉴定其E3泛素连接酶活性.方法 以肠出血性大肠杆菌O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因,构建重组表达载体pET22b-z2151,转化BL21(DE3),诱导蛋白表达,采用镍柱亲和纯化获取目的蛋白;通过体外泛素化实验检测蛋白泛素连接酶活性.结果 亲和纯化得到较高浓度和纯度的z2151蛋白,其在体外泛素化反应中能够促使泛素小分子形成多聚泛素链,即有E3泛素连接酶活性;而且对E2泛素结合酶具有一定的选择特异性.结论 原核表达质粒pET22b-z2151构建成功,目的蛋白z2151具有泛素连接酶的体外泛素化能力,并且针对不同的E2酶亲和力不同,这些都为后续功能机制研究奠定了基础.
关键词： 基因工程 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 泛素连接酶 体外泛素化 -
肠出血性大肠杆菌z4832基因缺失突变株的构建
目的 利用Red重组系统的同源重组功能,敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7 (EHEC O157∶H7)的乙酰转移酶基因z4832,构建z4832基因缺失突变株.方法 EHECO157∶H7的基因组作为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列;将上下游同源臂连接于pUC19-kana质粒上卡那霉素(kana)抗性基因的两端;PCR扩增获得中间嵌合卡那霉素抗性基因的同源臂线性片段,利用质粒pKD46介导的重组技术敲除z4832基因,利用pCP20质粒介导的重组技术去除抗性标记.PCR扩增及DNA测序验证目的基因缺失后,测定突变株及野生株的生长曲线,检测在抗菌药物氧氟沙星中的存活率.结果 成功构建EHEC O157∶H7 z4832基因缺失突变株.z4832缺失突变株生长速度与野生株差异无统计学意义,但在含氧氟沙星的LB培养基中突变株存活率升高(P＜0.05),在含氧氟沙星的M9培养基中存活率下降(P＜0.05).结论 构建z4832缺失突变株,研究z4832与肠出血性大肠杆菌耐药性之间的关系,为进一步研究乙酰转移酶在EHEC O157∶H7中的作用机制奠定了基础.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 Red重组系统 乙酰转移酶 抗生素 -
动物源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR快速检测研究
目的 建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7及其3个主要毒力基因(hylA、eaeA和stx2基因)的多重PCR方法.方法 根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素(hlyA)基因、紧密黏附素(eaeA)基因和志贺样毒素2(stx2)基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测.结果 该方法扩增目的基因片段分别为327 bp、247 bp、494 bp、384bp和779 bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104 cfu/mL.结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157∶H7的分子流行病学调查及食品微生物检测.
关键词： 动物源性 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 毒力基因 多重PCR -
肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的制备及鉴定
目的提取纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7脂多糖(LPS)抗原并对其鉴定,以探讨其应用于检测抗O157抗体的价值.方法应用热酚水法提取EHEC O157∶H7 S型933株LPS抗原,并经超速离心纯化.提取物以蒽酮硫酸法、紫外光谱吸收法、考马斯亮蓝染色法及鲎试剂分别测定多糖、核酸、蛋白含量和鲎试剂凝集活性.LPS抗原致敏醛化鸡血球,IHA法检测EHEC O157∶H7及其它肠道病原菌的抗血清.对凝集阳性的抗血清,经菌体抗原吸收、O157 LPS抑制及去脂质多糖抗原抑制试验,确定抗血清与LPS的反应位置.结果纯化后的O157 LPS抗原含多糖,具鲎试剂凝集活性,未检出核酸,蛋白含量＜0.5%.O157 LPS IHA检测O157多克隆和单克隆抗体均呈高效价凝集阳性反应,而大部分其它肠道病原菌抗血清均呈阴性反应,交叉反应仅见于沙门氏菌O30、EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清.EHEC O157和沙门氏菌O30抗血清与O157 LPS反应位置为多糖部分,而EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清的反应位置为脂质A部分.结论热酚水法提取的EHEC O157 LPS抗原纯度高、特异性强,可望应用于抗O157抗体的检测.O157 LPS抗原的去脂质可进一步提高反应的特异性.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 脂多糖 抗原 -
肠出血性大肠杆菌O157∶H7 TccP基因克隆、表达及其抗原性鉴定
目的 克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)基因,并研究其抗原性.方法 采用PCR法自EHEC O157:H7 Sakai菌株基因组扩增TccP基因,构建TccP原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达.表达产物经初步纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗TccP多克隆抗体.抗体效价及特异性用ELISA法和Western blotting法进行测定和分析.结果 从EHEC O157:H7 Sakai菌株中克隆出了1 014bp的TccP基因.构建的重组质粒pET28a-TccP在大肠杆菌中获得了高效表达;以TccP免疫家兔获得了高效价多克隆抗体,Western blotting分析此抗体能与TccP发生特异性抗原抗体反应.结论 在大肠杆菌中成功克隆表达了TccP基因,所获TccP具有良好的抗原性,为进一步研究TccP在EHEC O157:H7致病机制中的作用奠定基础.
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肠出血性大肠杆菌O157 LPS单克隆抗体的制备与鉴定
目的 建立能够分泌针对肠出血性大肠杆菌O157:H7表面抗原的特异性单克隆抗体,以期用于该病原菌的检测.方法 以敲除毒力基因的O157突变株F25全菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,分别以全菌抗原和热酚水法纯化的O157 LPS抗原用间接ELISA筛选能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,纯化抗体并鉴定.结果 建立了稳定分泌抗O157 LPS抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D6,分泌抗体属IgG3亚类,轻链为κ型.腹水抗体ELISA效价达1:3.2×106.以辛酸/饱和硫酸铵法纯化后抗体效价为1:1.6×106,亲和常数Ka大于6.14×10-11mol/L.用于协同凝集和间接荧光抗体试验具有良好的特异性.结论 该单克隆抗体针对O157的LPS抗原,特异性强,亲和力高,可用于O157的检测或分离鉴定.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LPS 单克隆抗体 免疫荧光 协同凝集 -
贵州省首次从腹泻病例中检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7
目的 从贵州省1例腹泻病例的粪便标本中分离鉴定O157肠出血性大肠杆菌并对其进行毒力基因检测.方法 收集腹泻病例的粪便标本,mEC肉汤增菌后,采用O157胶体金进行初筛,阳性者增菌液经免疫磁珠富集后进行肠出血性大肠杆菌的分离,对分离株进行系统生化鉴定,O157、H7诊断血清凝集,应用特异性PCR进行rfbE和fliC基因鉴定,以及stx1、stx2、eaeA和hlyA 4种毒力基因检测.结果 腹泻病例粪便标本经mEC肉汤增菌后,检测O157胶体金阳性;增菌液经免疫磁珠富集后培养出可疑菌落,经系统生化鉴定为大肠杆菌,血清型为O157∶H7;PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因均阳性;毒力基因eaeA、stx2和hly均阳性,stx1阴性.结论 分离株确诊为肠出血性大肠杆菌O157∶H7,为贵州省腹泻病例中首株该病原体.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 贵州 腹泻 PCR 毒力基因 -
江苏省肠出血性大肠杆菌0157∶H7 PFGE分子分型研究
目的:对我省历年分离的不同地区和来源EHEC O157∶H7菌株之间的同源性进行分析.方法:用限制性内切酶XbaI,对分离菌株进行PFGE分型,并使用BioNumerics Version 4.0软件(Dice系数和UPGMA法)进行聚类分析.结果:74株O157∶H7分离株可分为39个型,同一年份同一地区不同来源菌株之间有相同的XbaI酶切带型,同一年份不同地区分离菌株之间有相同酶切带型,不同年份部分菌株之间酶切带型不可区分.结论:我省宿主动物携带多个O157∶H7克隆,来自同一个克隆的O157∶H7已在较广泛的区域内传播,某些在1999年暴发流行的克隆长期稳定存在于我省宿主动物中,并传播给人类.
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肠出血性大肠杆菌O157∶H7活菌检测技术研究进展
大肠埃希菌(Escherichia,E.coli),俗称大肠杆菌,是一类寄居于人和动物肠道的正常菌群优势菌种,是人类重要的条件致病菌,可引起肠道内和肠道外的感染[1].肠出血性大肠杆菌(EHEC)是大肠杆菌的一个亚型,包括O157、O111、O26等血清型,O157∶H7是其常见的血清型之一,因可导致出血性肠炎而得名;可引起感染性腹泻,是与人类疾病相关的具代表性的血清型之一.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 活菌检测 综述 -
熔解曲线分析方法甄别肠出血性大肠杆菌O157∶H7
目的:采用熔解曲线分析技术,建立一种快速、简便、准确地甄别肠出血性大肠杆菌O157∶H7方法.方法:选取肠出血性大肠杆菌O157∶H7编码脂多糖基因(rfbE)和编码鞭毛抗原基因(fliC)作为检测靶基因,建立荧光PCR反应体系.结果:通过多种标准菌株试验,结果显示所建立的熔解曲线分析法可特异性地甄别肠出血性大肠杆菌O157∶H7；纯培养的灵敏度达到2.8×101 cfu/ml；检测108例临床样本,其中18例肠出血性大肠杆菌O157∶H7阳性,3例为肠出血性大肠杆菌O157∶非H7阳性,与常规培养方法的符合率达到100％.结论:本方法可简便、准确地甄别肠出血性大肠杆菌O157∶H7,结果可靠,通过进一步增加反应体系中引物的数量可同时对肠出血性大肠杆菌其他血清型进行鉴定.
关键词： 熔解曲线 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 甄别 -
用RAPD技术分析出血性大肠杆菌O157∶H7
目的应用RAPD技术分析肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DNA多态性并对其分型.方法用两条10bp的随机引物对3株肠出血性大肠杆菌O157∶H7和3株其它病原性大肠艾希氏菌进行扩增,扩增产物经凝胶电泳后得到指纹图.结果共得到12个不同的DNA指纹图谱,经统计软件SPSS系统聚类分析得到两个不同的分类树状图.结论 RAPD技术方法简便、快速、分辨力高,在肠出血性大肠杆菌O157:H7分子流行病学研究中有较大的应用前景.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 随机引物PCR DNA多态性 -
郑州市2005年肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染状况调查
目的:了解郑州市肠出血性大肠杆菌O157∶H7在腹泻病人中的检出情况和宿主动物带菌及毒力基因情况.方法:对采集的宿主动物和腹泻病人粪便及食品应用免疫磁珠富集分离法进行大肠杆菌O157∶H7分离和鉴定.结果:郑州市内共发现3例肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染病例,首次从腹泻病人中检出产毒O157∶H7菌株,采集5种以上动物粪便标本共计475份,从牛粪(247份)中分离到16株O157∶H7,检出率为6.48%,从羊粪(33份)中分离到3株O157∶H7,检出率为9.10%,并检出3株产毒O157∶H7菌株.采集5类市售食品共146份,未分离到O157∶H7.结论:郑州市存在发生肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染暴发或流行的潜在危险.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 宿主动物 监测 -
改良RNA提取法应用于RT-PCR检测O157∶H7活菌
目的 将改良的RNA提取法应用于RT-PCR,建立一种快速灵敏检测肠出血性大肠杆菌O157:H7活菌的方法.方法 以O157∶H7 rfbE基因为靶基因设计引物,样品中加入较大浓度的非目标菌后,用TRIzol试剂提取细菌总RNA后,gDNA Eraser去除其中污染的DNA,通过RT-PCR检测O157∶H7 rfbE的mRNA.结果 RT-PCR法能有效检测样品中的O157∶H7活菌,死菌不被检测.未加入非目标菌(志贺菌)检测O157∶H7检出限为3.4×108 cfu/ml,加入非目标菌共沉淀提取RNA,检出限下降至3.4×105 cfu/ml,检测灵敏度提高了1 000倍.结论 改良RNA提取法应用于RT-PCR能够快速灵敏检测O157∶H7活菌,在突发公共卫生事件的应急处理方面有良好的应用前景.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 RNA 逆转录聚合酶链反应 -
EMA-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7
目的 将叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术相结合,建立一种有效、快速检测活肠出血性大肠杆菌O157∶H7的方法.方法 以rfbE为PCR检测靶基因,O157∶H7培养物经EMA处理后制备模板进行PCR检测,并对EMA使用浓度、作用时间等进行优化.结果 不抑制O157∶H7活菌PCR扩增的大EMA浓度为10 μg/mL;抑制2×107 CFU/mL死菌PCR反应的小EMA浓度为0.5 μg/mL;该法对O157∶H7检测的灵敏度为2×104 CFU/mL,结果显示能检出混合体系中含有的1％的活菌.结论 EMA PCR技术能有效检测活的O157∶H7,在突发公共卫生事件的快速检测中具有良好的应用前景.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 PCR 叠氮溴化乙锭 活菌检测
