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华蟾素注射液联合放疗对食管癌细胞增殖与周期的影响
目的:观察华蟾素注射液对食管癌细胞ECA109增殖的抑制作用,分析华蟾素联合X射线照射对细胞周期的影响,探讨华蟾素注射液与放疗联合效应的机制.方法:实验分空白组、华蟾素组、放疗组、华蟾素+放疗组,作用食管癌ECA109细胞48 h后,应用噻唑蓝(MTT)比色法检测华蟾素注射液对ECA109细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测细胞周期的变化,反转录-PCR(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测各组泛素连接酶(RNF2),p16和周期蛋白依赖性激酶(CDK4) mRNA和蛋白表达.结果:华蟾素可显著抑制食管癌ECA109细胞的增殖,且呈浓度和时间依赖性.与空白组比较,各药物组中DNA合成前期(G0/G1期)细胞比例明显升高(P<0.05),S期细胞比例明显下降(P<0.05).与空白组比较,华蟾素+放疗组中RNF2 mRNA和蛋白明显降低(P<0.05),且各药物组均能促进p16 mRNA和蛋白表达(P<0.05),抑制CDK4 mRNA和蛋白水平(P<0.05).结论:华蟾素注射液能有效抑制人食管癌ECA109细胞增殖,并将细胞阻滞于G0/G1期,机制可能与降低RNF2,CDK4水平,上调p16基因水平相关.
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泛素连接酶MDM2促进外源NOLC1的泛素化和降解
目的 研究泛素连接酶MDM2对其调节因子NOLC1的泛素化和降解.方法 克隆原核表达了NOLC1全长蛋白和其核定位信号区域,在体外泛素化体系中利用有泛素连接酶活性的重组MDM2研究其对NOLC1的泛素化.在哺乳动物细胞中,研究MDM2对外源转染的NOLC1的降解.结果 在体外泛素化体系中MDM2泛素化NOLC1全长和其核定位信号区域;在哺乳动物细胞中,MDM2促进外源NOLC1降解超过70%,且NOLC1的降解通过蛋白酶体途经实现.结论 MDM2促进外源NOLC1的泛素化和降解,为研究MDM2-TP53-NOLC1之间的相互调节提供了新的线索.
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泛素连接酶LNX1促进外源PBK的泛素化和降解
目的 研究LNX1对其相互作用蛋白PBK的泛素化和降解.方法 克隆、原核表达、纯化了一系列重组人LNX1截断体蛋白和LNX1全长蛋白;在体外泛素化体系中研究其对PBK的泛素化,哺乳动物细胞内研究其对外源PBK的泛素化和降解.结果 在体外泛素化体系中LNX1泛素化PBK,并研究了不同LNX1截断体对PBK泛素化的影响;发现在哺乳动物细胞内外源LNX1促进外源PBK的泛素化,进而导致其通过蛋白酶体降解.结论 研究发现了LNX1对外源PBK的泛素化和降解,为研究LNX1的生理功能提供了重要线索.
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泛素连接酶hHrd1在人乳腺癌组织表达的意义
目的 探讨一种泛素连接酶hHrd1在人乳腺癌发病中的病理意义.方法 应用免疫组织化学SP法研究正常人乳腺组织、乳腺增生症、乳腺纤维腺瘤、原发性乳腺癌组织中hHrd1的表达.结果 人乳腺癌组织hHrd1蛋白表达水平明显强于正常人乳腺组织、乳腺增生症、乳腺纤维腺瘤.导管内癌(或伴早浸)与浸润性导管癌相比,表达水平低,差异有显著性意义(P<0.05).人乳腺浸润性导管癌组织hHrd1表达与肿瘤大小有关(P<0.05),与组织学分级、淋巴结是否转移无关(P>0.05).结论 泛素连接酶hHrd1参与人乳腺癌的发生.
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E3泛素连接酶CUL4A在肿瘤发生发展中的作用及机制
泛素化修饰在肿瘤的发生发展中具有重要作用,其中E3泛素连接酶Cullin 4A (CUL4A)能够通过与DDB1相结合而泛素化多种底物,介导其降解.目前,已经证实在多种肿瘤中均有CUL4A基因的异常表达.本文将总结有关CUL4A在人类恶性肿瘤中的相关作用及分子机制,并讨论将其作为防治肿瘤新靶点的研究进展,为进一步开展CUL4A在肿瘤发生中的研究提供参考.
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E3泛素连接酶 VHL 通过调控 HIF-1α维持 Treg 稳态及功能
调节性 T 细胞(regulatory T cell,Treg)是 CD4+ T 细胞的重要亚群,参与了免疫耐受和对自身抗原的耐受反应。Von Hipp-el-Lindau(VHL)基因的失活或者突变促进多种肿瘤发生。HIF-1α是 VHL 复合物的底物,在常氧状态下,HIF-1α经脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain,PHD)的羟化后被 VHL 识别,进而被泛素化修饰,再经由蛋白酶体降解,所以维持在较低水平。有研究表明,HIF-1α参与维持 Th17和 Treg 平衡。本文作者,对于 VHL 是否参与了 Treg 细胞的调控进行了研究。
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华支睾吸虫parkin蛋白的分子生物学特征研究
目的 了解华支睾吸虫Parkin蛋白(Clonorchis sinensis Parkin)的生物学特性. 方法 从华支睾吸虫cD-NA文库获得Parkin的cDNA全长,NCBI搜索与之相似度高的基因序列,预测其所含结构域和功能;应用MEGA5程序对来自GenBank中与之有较高相似度的基因序列进行分析,构建基因进化树;原核表达重组融合蛋白CsParkin,纯化后免疫Blab/c小鼠,获得多克隆抗体,采用Western blot鉴定天然CsParkin;采用qRT-PCR测定CsParkin基因在不同发育阶段的表达水平. 结果 CsParkin蛋白含有5个结构域,分别是Ubl、RING0、RING1、IBR和RING2,具有典型的Parkin蛋白结构;该蛋白与人及各种动物的Parkin有很高的相似度,与其他吸虫有更近的进化关系;Western blot显示原核表达的重组CsParkin,与天然CsParkin分子质量相同,均为45.7 ku;CsParkin在囊蚴中的表达量高于成虫;免疫组化显示CsParkin主要分布于成虫受精囊中的精子及口吸盘和睾丸,在囊蚴中广泛分布. 结论 肝吸虫CsParkin属蛋白于保守蛋白,具有典型的泛素连接酶3的功能结构,推测其在蛋白的泛素化中起到作用,可能在华支睾吸虫的生长过程中发挥作用.
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去泛素化酶在病毒感染过程中的调控作用研究进展
蛋白质的泛素化是一种广泛存在且非常重要的翻译后修饰形式,在调控细胞周期、细胞凋亡、损伤修复、机体免疫以及神经元退化等许多生物学功能方面发挥着重要作用,其过程需泛素或类泛素样蛋白(如SUMO、NEDD8、ISG15等)、泛素激活酶 E1、泛素结合酶 E2和泛素连接酶 E3共同完成[1-2]。泛素是由76个氨基酸残基组成的非常保守的小分子多肽,相对分子质量为8.5×103,在真核生物体内广泛存在[3]。泛素本身含有7个赖氨酸残基(lysine, K),分别为K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63,其本身的赖氨酸残基也可以与泛素分子相互结合,即底物蛋白结合泛素分子,后一个泛素分子通过其羧基端的甘氨酸结合到前一个泛素的某一个赖氨酸上形成多聚泛素链。多聚泛素链与被修饰蛋白K48相连常介导靶蛋白进入蛋白酶体降解,而K63连接常活化靶蛋白或使靶蛋白循溶酶体途径降解。在这个过程中E1活化泛素分子, E2决定着形成何种泛素链,而E3则决定着底物蛋白的特异性[4-7]。
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泛素蛋白酶体在骨骼肌高分解代谢中的意义
蛋白质在细胞内的降解是极其复杂又高度有序的过程,真核细胞中的蛋白质降解绝大多数是由泛素系统完成的.泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)具有高效、高选择性依赖ATP的细胞内蛋白质降解途径.蛋白质首先是被泛素分子识别,在泛素分子的介导下,由泛素活化酶E1、泛素载体蛋白E2以及泛素连接酶E3特异性作用,随后再与26S蛋闩酶体相偶联,被26S蛋白酶体内部哑单位多次切割降解为多个肽段,且多聚泛素链被还原成单体参与下一轮蛋白质降解.
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Skp2、p27及PTEN在胰腺癌组织中的表达及其意义
大多数恶性肿瘤的形成过程中都存在细胞周期的紊乱.细胞s期激酶相关蛋白2(S-phase-kinase associated protein 2,Skp2)是泛素连接酶SCF(skpl-cull-F-box protein,SCF)的底物识别亚单位,主要通过识别p27进而介导其泛素化降解来调控细胞周期,是细胞周期由G_1期进入S期所必需的~([1,2]).
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MuRF-1和MuRF-2基因罕见变异增加肥厚型心肌病外显率
背景:肥厚型心肌病(HCM)是常见的单基因遗传心血管疾病。该疾病具有明显临床异质性,部分患者易发生心源性猝死和心衰。MuRF蛋白家族包括MuRF-1、MuRF-2和MuRF-3,它们分别由TRIM63、TRIM55和TRIM54基因编码,是在横纹肌特异表达的一类E3泛素连接酶。它们能够通过降解肌小节蛋白和心肌肥厚相关转录因子,调控心肌细胞收缩和大小。近有研究发现MuRF-1突变能够导致HCM。
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泛素连接酶在骨形成调节中的作用
泛素-蛋白酶体系统是维持细胞内蛋白质稳态和功能的重要调节途径,泛素化参与调节细胞的增生、分化和存活,泛素化调节异常可导致代谢性骨病、肿瘤等疾病的发生.越来越多的证据表明泛素-蛋白酶体系统参与调控成骨细胞功能和骨形成.泛素连接酶(E3 ubiquitin ligases,E3)作为泛素和底物蛋白之间的衔接分子可特异性识别底物,在骨形成相关蛋白调节和骨转换过程中具有重要的意义.既往研究表明E3连接酶通过介导酪氨酸激酶受体、信号蛋白和转录因子等参与成骨细胞增生、分化、存活和骨形成的调节.Smurf1、Cbl和SCFβ-TrCP等E3连接酶可特异性介导Runx2、MEKK2、JunB、β-catenin、Gli2、ATF4等成骨细胞分化重要调节蛋白的降解,抑制成骨功能.E3连接酶作为促进骨形成和减少骨丢失理想的治疗靶标,具有广阔的研究前景.本文对E3连接酶在骨形成调节中的作用及机制进行回顾和总结.
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Arkadia上调转化生长因子-B信号促进卵蛋白致敏大鼠气道重塑形成
支气管哮喘(简称哮喘)所致气道重塑的发生与转化生长因子(TGF)-β信号通路的活化密切关联.TGF-β生物学效应的发挥在很大程度上依赖于泛素蛋白酶体通路对TGF -β/Smad通路中基本信号分子的降解而得以实现.在上述过程中,E3泛素连接酶Arkadia和Smurf2能够诱导Smad7、SnoN和Ski的泛素化降解.本研究为明确卵蛋白致敏大鼠气道重塑发生过程中Arkadia和Smurf2对TGF-β信号通路的调控作用,采用卵蛋白致敏、激发方法建立慢性气道重塑大鼠模型;体外培养正常人支气管上皮细胞( NHBEC),用TGF-β1对NHBEC进行刺激,在此过程中分别用Arkadia-siRNA、Smurf2 -siRNA及蛋白酶抑制剂(lactacystin)对NHBEC进行预处理.
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CKIP-1与骨质疏松的新研究进展
骨质疏松是严重威胁中老年人健康的骨科常见病.酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2 interaction protein 1,CKIP-1)是近年来发现的一种重要分子,它通过与其他分子的相互作用在许多细胞行为中都发挥着重要的作用.CKIP-1是参与调节骨形成的重要的蛋白因子,与骨质疏松有密切联系,并已成为药物设计的新靶点.因此,对其的深入研究将为骨质疏松、病理机制阐明及骨疾病防治带来积极影响.本文就CKIP-1与骨质疏松症的关系进行综述.
关键词: 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1 骨质疏松 泛素连接酶 -
多发性硬化患者外周血淋巴细胞Cbl-b的表达
目的 分析多发性硬化(MS)患者外周血淋巴细胞Cbl-b基因和蛋白的表达变化并探讨其与MS发病的关系.方法 采用RT-PCR和Western-blot方法检测31例MS患者(缓解期20例、急性复发期11例)和16名健康对照者外周血淋巴细胞Cbl-b mRNA和蛋白的表达.结果 (1) MS患者外周血淋巴细胞Cbl-b mRNA和蛋白表达水平均较健康对照组明显下调;(2)急性复发期和缓解期MS患者外周血淋巴细胞Cbl-b mRNA表达水平差异无统计学意义;(3)急性复发期MS患者外周血淋巴细胞Cbl-b蛋白表达水平较缓解期患者明显下调.结论 外周血淋巴细胞Cbl-b mRNA和蛋白表达下调可能参与了MS发病,且蛋白表达的进一步下调可能与MS急性复发相关.
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泛素连接酶Smurf1促进PDK1的多聚泛素化修饰
目的 探讨3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)发生多聚泛素化修饰的机制.方法 免疫共沉淀(CO-IP)和免疫印迹(WB)分析PDK1的多聚泛素化修饰,MEF细胞内印证泛素连接酶Smad泛素化修饰调节因子1 (Smurf1)增强PDK1多聚泛素化修饰,定点突变和CO-IP及WB确定PDK1多聚泛素化修饰位点.结果 PDK1可发生多聚泛素化修饰,泛素连接酶Smurf1增强PDK1多聚泛素化修饰,且依赖HECT类泛素连接酶Smurf1 K699位点活性;K304是PDK1多聚泛素化修饰位点.结论 泛素连接酶Smurf1增强PDK1的多聚泛素化修饰.
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泛素连接酶APC/C在细胞周期调控中的作用
一、APC/C在泛素途径中地位1(anaphase promoting complex,cyclosome,APC/C)细胞周期后期促进复合物是由多个亚基组成的1.5MD的E3泛素连接酶,与细胞的有丝分裂和减数分裂有着密切的关系.APC/C复合物通过磷酸化和激活、抑制因子的调节来实现在不同细胞周期的阶段其底物泛素化的特异性.
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神经调节素受体降解蛋白1的研究进展
泛素化是体内蛋白质降解的重要方式.泛素连接酶是泛素化过程中的关键酶.神经调节素受体降解蛋白1(Nrdp1)是一种新的泛素连接酶,具有泛素连接酶活性,Nrdp1可以通过泛素化降解或激活底物分子来发挥生物学功能.近年来发现Nrdp1通过降解ErbB3调节细胞增殖,与凋亡抑制蛋白相互作用介导细胞凋亡,通过泛素化降解髓样分化因子和激活干扰素调节因子抵抗炎症反应,且研究发现Nrdp1与肿瘤、中枢神经系统疾病、造血系统疾病和心血管系统疾病等的发生、发展密切相关.
关键词: 神经调节素受体降解蛋白1 泛素连接酶 泛素-蛋白酶体系统 -
军事医学科学院发现结直肠癌发病新机制
英国《自然-通讯》5月13日晚在线发表了军事医学科学院放射与辐射医学研究所张令强课题组在结直肠癌发病机制方面的新成果。此项研究首次在国际上揭示泛素连接酶Smurf1是促进结直肠癌发生发展,并且导致患者预后差的一个重要因子。谢萍、张明华、何珊等研究人员通过对336例患者的结直肠癌样本分析发现,泛素类蛋白通路的修饰酶体系在结直肠癌中也呈现高表达,它们与Smurf1协同作用,促进了对抑癌蛋白的快速降解,从而解释了Smurf1为何具有促癌功能。
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靶向敲减Ras癌蛋白融合型泛素连接酶E3的构建
目的 应用蛋白质敲减技术原理,构建理论上能够靶向敲减Ras癌蛋白的融合型泛素连接酶E3的真核表达载体.方法 选取Raf-1、PI3K、RalGDS中能够与Ras蛋白相互作用的结合结构域和具有泛素连接酶活性的F-Box及U-Box作为功能结构域,采用分子克隆技术依次将其连入pcDNA3.1中构建融合蛋白表达载体,双酶切、PCR和测序技术检测连入核苷酸片段的正确性,Western blot检测融合蛋白表达载体在真核细胞内表达的正确性和作用有效性.结果 成功获得6个融合蛋白E3表达载体,5个能够在真核细胞内有效表达,其中(RBD+ CRD) Raf-1 -U-Box-pcDNA3.1能够敲减人胰腺癌细胞系PANC-1细胞中Ras蛋白.结论 成功构建能够靶向敲减Ras癌蛋白的融合蛋白表达载体,为下一步应用蛋白质敲减技术奠定了实验基础.