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中国麻疹野病毒基因型快速诊断方法的建立
研究建立了一种适用于中国现流行麻疹野病毒基因型的基因型别筛查、定型的分析方法,即逆转录-聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析(RT-PCR-RFLP).首先对RT-PCR方法的敏感性和特异性进行了实验证明,对11株麻疹病毒提取核糖核酸(RNA),逆转录套式PCR扩增后全部出现阳性特异条带.在同样的反应条件下,扩增6种不同基因型麻疹病毒9株,同时又扩增其它非麻疹病毒.结果9株6种基因型麻疹病毒RT-PCR均呈现阳性条带,说明本研究采用的RT-PCR方法敏感.而非麻疹病毒RT-PCR结果为阴性,均未见阳性条带,说明该RT-PCR方法特异.根据H1和H2基因型麻疹病毒分别被不同的限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ切割成不同大小的基因片段,建立RFLP快速基因定型方法.之后,对建立的RFLP方法的特异性和敏感性进行了实验证明.利用该方法对吉林省连续两年分离到的9株麻疹野病毒[已经过中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家麻疹实验室脱氧核糖核酸(DNA)序列分析证实为H1基因型]进行验证,结果均为H1基因型麻疹病毒,证实该PCR-RFLP结果与序列分析结果一致,也说明该方法敏感.同时,又对7种不同基因型麻疹病毒应用PCR-RFLP方法进行实验,结果只有H1和H2基因型麻疹病毒被限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别切成2个不同大小的基因片段,其它基因型麻疹病毒由于无SalⅠ和BamHⅠ酶的切位点,所以未被切开,说明所建立的PCR-RFLP方法特异,只针对中国流行的麻疹病毒基因型.研究证明,RFLP是一种快速、简便又经济实用的麻疹病毒基因定型筛查方法.
关键词： 麻疹病毒 逆转录-聚合酶链反应 限制性内切酶片段长度多态性分析 电泳 序列分析 敏感性 特异性 -
应用16S-23S rRNA基因区间对败血症常见菌的鉴定
目的建立检测不同菌种细菌的 16S-23S rRNA基因区间的特异图谱.方法应用聚合酶链反应(PCR)、限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)、分子克隆及测序技术,对临床常见的代表20个属26个种的标准菌株及相应的临床分离菌株共61株进行PCR扩增,同时对临床标本进行培养并与PCR-RFLP比较,探讨其在临床应用中的价值.结果 26株不同的标准菌株行PCR扩增后,分别出现1条带,2条带,3条带及多条带的不同DNA 图谱,其敏感性为2.5 CFU,与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应.其中14种菌经PCR扩增即可区分,另10种经Hinf I或Alu I 酶切后才能区分.肺炎克雷伯菌与坚韧肠球菌间的差异在第779位碱基上不同,Xma Ⅲ酶能进行区别.临床42例血培养15例阳性,阳性率35.7%;而PCR阳性27例,阳性率达64.3%,其阳性率明显高于血培养(P<0.01).6例脑脊液标本中1例培养为表皮葡萄球菌,其PCR也阳性,2例培养阴性标本,其PCR也阳性,经图谱分析为葡萄球菌,1例培养为新型隐球菌的脑脊液标本PCR检测为阴性.另2例PCR及培养均阴性.结论建立了PCR加RFLP技术快速检测细菌16S-23S rRNA基因区间的方法,进一步为临床细菌感染的病原诊断提供了新的科学依据.
