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PLCε在日本血吸虫尾蚴性皮炎中的作用机制研究
目的 探讨磷脂酶Cε(PLCε)在日本血吸虫(SJ)尾蚴性皮肤炎症中的作用机制. 方法 用日本血吸虫尾蚴感染PLCε基因敲除(KO)和PLCε野生型(WT)两组小鼠,建立Ⅰ型和Ⅳ型超敏反应模型.于感染后不同时间点提取小鼠感染处皮肤组织,部分制作冰冻组织切片,用于HE染色检查和免疫荧光染色检查;部分组织提取总RNA,采用qRT-PCR方法检测相关炎症细胞因子mRNA表达水平. 结果 HE染色显示,Ⅰ型超敏反应模型中PLCε KO和WT两组皮肤肥厚度和炎性细胞浸润数量差异无统计学意义(P均＞0.05).在Ⅳ型超敏反应模型,KO小鼠炎症反应显著减弱,与WT组相比皮肤增厚程度减轻(t48h=5.317,P=0.000 t72h=10.162,P=0.000),且炎性细胞浸润数量显著减少(t48h=2.888,P=0.020).qRT-PCR检测T细胞衍生因子IL-4,IFN,IL-17及IL-23 mRNA表达在WT与KO组间差异无统计学意义(IL-4:t24h=0.496,P=0.625;IFN:t24h=-0.035,P=0.973;IL-17:t24h=0.112,P=0.938;IL-23:t24h=-1.151,P=0.261).但成纤维细胞和角质形成细胞等体细胞所诱导的炎症细胞因子IL-1α,IL-1β以及趋化因子Cxcl-1,Cxcl-2 mRNA表达在KO组受抑制(IL-1α:t12h=4.785,P=0.000;t24h =2.109,P=0.046;IL-1βt6h=3.187,P=0.004;t12h=5.049,P=0.000;Cxcl-1:t12h=4.858,P=0.000;Cxcl-2:t24h=7.957,P=0.000). 结论 PLCε在日本血吸虫尾蚴性皮炎中通过调控体细胞的细胞因子的表达而影响炎症反应.
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BBN诱发PLCε基因敲除小鼠膀胱癌发生过程中病变细胞超微结构改变
目的 动态观察诱癌剂N-丁基-N2(4-羟丁基)亚硝胺(BBN)诱发磷脂酶Cε(PLCCε)基因正常(PLCε+/+)小鼠和PLCCε基因敲除(PLCCε+)小鼠膀胱肿瘤超微结构发生发展的过程,研究PLCε在膀胱肿瘤形成中的作用.方法 PLCε+/+和PLCε-/-小鼠各72只随机分成2组,分别给予BBN和自来水喂饲,实验周期为18W,按计划处死大鼠,在电子显微镜下观察不同阶段动物膀胱癌的发生情况.结果 PLCε+/+小鼠和PLCε-/-小鼠膀胱癌的发生经历了3个阶段的形态变化过程:(1)上皮增生期;(2)乳头状瘤形成期;(3)癌变期.电镜显示的各阶段超微结构变化,以膀胱黏膜移行上皮表层细胞的变化具有形态学意义,其中移行上皮非对称性单位膜的改变、多形性微绒毛形成、梭形小泡形成、微丝及连接复合体减少所致的壳层丧失,胞浆内溶酶体增多及印戒细胞形成、核周纤维层不规则或消失是癌变的重要依据,因此可作为膀胱黏膜上皮早期癌变的超微结构学标志.结论 PLCε-/-鼠的肿瘤形成时间迟于PLCε+/+小鼠,肿瘤发生率也低于PLCε+/+小鼠提示敲除PLCe基因可以抑制膀胱肿瘤的形成.
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吡柔比星通过PLCε-Bcl-2通路抑制膀胱癌细胞增殖
目的 探讨吡柔比星对膀胱癌细胞增殖的影响及其作用机制.方法 膀胱癌细胞T24和BIU-87分别用0.4、0.8、1.6、3.2 mg/L的吡柔比星处理24、48、72 h,用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率,qRT-PCR、RT-PCR检测磷脂酶Cε(PLCε) mRNA及凋亡调控基因Bcl-2 mRNA的表达,蛋白质印迹法检测PLCε蛋白的表达.将膀胱癌细胞分为空白组、毗柔比星处理组、Ad-shPLCε处理组、吡柔比星联合PLCε干扰腺病毒载体(Ad-shPLCε)处理组,检测并比较各组细胞增殖和Bcl-2蛋白的表达量.结果 在膀胱癌细胞T24、BIU-87中,毗柔比星对细胞的抑制率呈浓度、时间依赖性,即随着药物浓度增加、处理时间延长,细胞抑制率升高;吡柔比星促进T24和BIU-87细胞凋亡,并且抑制PLCε和Bcl-2表达.吡柔比星处理组、Ad-shPLCε处理组、Ad-shPLCε联合吡柔比星处理组均能抑制细胞增殖和Bcl-2表达,且Ad-shPLCε联合吡柔比星处理组的抑制作用高于吡柔比星处理组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 吡柔比星能有效抑制膀胱癌细胞的增殖,可能与其抑制PLCε癌基因及下游Bcl-2基因的表达有关.
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磷脂酶Cε基因在膀胱移行细胞癌中表达及其临床意义
目的 探讨磷脂酶Cε(phospholipase Cε,PLCε)基因在膀胱移行细胞癌表达及临床意义.方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测27例膀胱移行细胞癌和12例正常膀胱对照组中PLCε mRNA表达,分析其与膀胱病理学特征的关系.结果 PLCεmRNA在膀胱移行细胞癌的表达显著高于正常膀胱组织(P＜0.01),PLCε的表达和膀胱移行细胞癌分期有关(P＜0.05)而与分级无关(P＞0.05).结论 PLCε基因在膀胱移行细胞癌组织中呈高表达,可能是未来检测膀胱移行细胞癌一种新的有价值的肿瘤标志物,同时也可能成为膀胱肿瘤生物学治疗中一个新靶点.
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PLCε基因通过NF-κB/p65途径抑制肾癌786-0细胞的增殖
目的 探讨RNA干扰技术沉默人源磷脂酶Cε(PLCε)基因对肾癌786-0细胞p65核转位的调控,对786-0细胞增殖的影响及其机制.方法 用携带PLCε shRNA基因的真核表达质粒pGenesil-PLCε转染786-0细胞,克隆形成实验检测786-0细胞的增殖,RT-PCR检测PLCε、c-Myc和COX-2 mRNA的表达,Western blot检测PLCε、c-Myc、COX-2和p65总蛋白及p65在细胞核的表达,细胞免疫荧光检测p65在细胞核与细胞质的定位.同时应用p65特异的抑制剂BAY11-7082处理786-0细胞,Western blot检测c-Myc和COX-2蛋白的表达.结果 转染pGenesil-PLCε质粒的786-0细胞生长明显受抑制;转染pGenesil-PLCε质粒细胞中PLCε、c-Myc和COX-2 mRNA和蛋白表达水平均较对照组pGenesil-NP明显下调(P＜0.01),且抑制核中p65蛋白的表达(P＜0.01),细胞免疫荧光结果显示转染pGenesil-PLCε质粒组p65在细胞核中的表达较对照组pGenesil-NP明显下降;BAY11-7082抑制c-Myc和COX-2蛋白的表达(P＜0.01),且呈时间浓度依赖性.结论 沉默PLCε基因后可能是通过抑制p65的核转位及c-Myc、COX-2的表达抑制786-0细胞的增殖.
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PLCε特异性shRNA对人膀胱癌生物学行为的影响
目的 探讨人源磷脂酶Cε(PLCε)特异性短发夹RNA(shRNA)对人膀胱癌增殖、凋亡、侵袭、转移能力的影响.方法 用携带PLCε shRNA基因的真核表达质粒pGenesil- PLCε转染BIU-87细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测各组细胞PLCε mRNA和蛋白的变化.分别用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、流式细胞术和免疫组化检测BIU-87细胞及裸鼠移植瘤增殖情况和细胞周期的变化;采用RT-PCR检测各组细胞Bcl-2、Bax mRNA的变化;采用Transwell小室体外侵袭法及明胶酶谱分析细胞的侵袭能力.结果 转染pGenesil-PLCε质粒的细胞可明显抑制PLCε基因和蛋白表达水平(P<0.05);MTT、流式细胞术与免疫组化检测结果表明转染pGenesil- PLCε质粒的细胞生长明显受抑制(P<0.05),且细胞周期阻滞于G0/G1期;转染pGenesil- PLCε质粒的细胞 Bcl-2/Bax mRNA明显降低(P<0.05);明胶酶谱及侵袭实验显示转染pGenesil- PLCε质粒的细胞侵袭、转移能力明显下降(P<0.05).结论 特异性shRNA干扰PLCε基因可抑制膀胱癌的生长,其作用机制可能与抑制肿瘤增殖、诱导细胞凋亡及抑制侵袭转移有关,PLCε为膀胱癌基因治疗的潜在靶点.
