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PCR-RFLP鉴别微小按蚊亲缘种A和C
目的建立微小按蚊复合体不同亲缘种A和C的分子鉴别方法-PCR产物酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP). 方法用单蚊蚊腿消化提取基因组DNA,PCR特异扩增核糖体28S第3结构域 (D3)基因,对PCR产物进行纯化、克隆和测序;分析微小按蚊A和C D3基因的酶切图谱,选择合适的限制性内切酶对两者PCR产物进行特异性切割, 按照酶切片段长度区分两亲缘种. 结果微小按蚊A被限制性内切酶 MboII切割后在约376 bp、268 bp和108 bp处出现3条条带,而微小按蚊C因第96 bp、97 bp位点突变,不存在限制性内切酶 MboII的特异识别位点而未被消化,仅在376 bp处存在唯一条带. 结论本实验建立的PCR-RFLP分子鉴别方法能有效地将形态难以鉴别的微小按蚊亲缘种A和C(GenBank: AF416782, AF415594)区分开来.
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进化速率不同的分子标记对微小按蚊新亲缘种的研究
目的 选择进化速率不同的核糖体rDNA-ITS2、rDNA-28S-D3基因和线粒体DNA(mtDNA)COⅡ基因作为分子标记,研究我国微小按蚊变异及新的亲缘种. 方法 用蛋白酶K消化单蚊蚊腿,提取基因组DNA,PCR特异扩增rDNA-ITS2、rDNA-28S-D3和mtDNA-COⅡ基因片段,对PCR产物进行纯化、测序和序列分析,并基于mtDNA-COⅡ基因采用大似然法构建种系发生树,分析微小按蚊变异地位和进化关系. 结果 1)云南元江微小按蚊rDNA-ITS2扩增片段约700 bp,其他微小按蚊为480 bp左右;2)ITS2和D3序列分析显示3种单倍型,其中元江微小按蚊基因长度与碱基组成显著不同;3)mtDNA-COⅡ种系发生树显示元江微小按蚊与其他微小按蚊的亲缘关系较远. 结论 我国存在微小按蚊A和C之外的新的微小按蚊亲缘种.
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核糖体28S-D3等位基因特异扩增鉴别微小按蚊亲缘种A和C
目的建立微小按蚊复合体不同亲缘种A和C的分子鉴别方法.方法用单蚊蚊腿消化提取基因组DNA,PCR特异扩增28S第3结构域(D3)基因,对PCR产物进行纯化、克隆、测序和序列分析;基于序列差异设计特异引物,进行等位基因特异扩增(PCR-ASA),根据扩增片段大小区分微小按蚊不同亲缘种.结果发现微小按蚊不同亲缘种A和C(GeneBank登录号:AF416782,AF425594), 根据二者序列差异设计的特异引物能在普通琼脂糖凝胶上直观地区分两亲缘种,两者除在376 bp处有一共同条带外,分别在294 bp和112 bp处出现各自的特异扩增带.结论我们建立的ASA分子鉴别方法能有效地将我国微小按蚊不同亲缘种A和C区分开来.
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分子生物学技术在蚊虫分类中的应用
在蚊虫分类中,长期以来都是以形态特征作为分类的依据,然而许多复合体的相继发现,亲缘种的存在,使得单纯的形态分类学无法对其进行鉴别.
