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贵州牛带绦虫亚洲亚种实验感染家猪的研究
目的观察贵州省牛带绦虫亚洲亚种囊尾蚴在猪体内的发育情况. 方法用牛带绦虫亚洲亚种孕节直接灌喂当地圈养的14 d龄健康乳猪8头,并以健康乳猪4头作对照.于感染后40、50、60和75 d分别剖检,观察猪体内囊尾蚴的分布、大小、形态及成熟情况. 结果从感染后40 d起,在6头猪的肝脏表面和实质内共检获421个囊尾蚴,多分布在肝实质内,其大小为1.34～2.78 mm×1.22～2.31 mm.其余部位未找到囊尾蚴.感染后40 d和50 d,囊尾蚴经胆汁孵育,头节翻出率分别为78.3%和93.4%.感染后50 d开始发现钙化的囊尾蚴.囊尾蚴活体观察可见头节上4个吸盘和活动的顶突.压片染色镜检,头节有4个吸盘和顶突,顶突周围发现不完整的两圈点状结构. 结论根据囊尾蚴的分布、大小、发育时间及形态特征,进一步认定贵州省都匀市的带绦虫为牛带绦虫亚洲亚种.家猪是其可能的中间宿主.
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云贵两省三地带绦虫的分子鉴定--核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析
目的用PCR-RFLP方法对rDNA-ITS1片段进行分析,以进一步明确云贵地区是否存在牛带绦虫亚洲亚种,并建立一种快速鉴定方法. 方法 取贵州都匀株(DY)、贵州从江株(CJ)、云南大理株(DL)带绦虫及台湾株(TW)成虫标本,剪取孕节,抽提DNA,PCR扩增rDNA- ITS1片段,分别用4种限制性内切酶MspI、CfoI、AluI、RsaI对扩增片段作酶切分析. 结果 PCR产物经AluI、RsaI酶切后, TW、DL、DY和CJ株RFLP图谱一致;经MspI、CfoI酶切后,TW、DL和DY株RFLP图谱一致,CJ株显著不同. 结论 1)DL和DY株与TW株同属牛带绦虫亚洲亚种;而CJ株是传统牛带绦虫;2)rDNA-ITS1的PCR-RFLP分析方法简便,可以用于带绦虫的分类学研究.
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牛带绦虫亚洲亚种乳酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫原性分析
目的 对牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因(LDH)进行克隆、表达和免疫原性分析. 方法 将牛带绦虫亚洲亚种成虫TaLDH克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物通过十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白pET-30a(+)-TaLDH用蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果 均显示重组质粒pET-30a(+)-TaLDH构建成功.SDS-PAGE结果 表明,目的 基冈在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白,浓度为0.9 mg/ml.Western blotting分析结果 显示,重组蛋白pET-30a(+)-TaLDH能识别感染牛带绦虫亚洲亚种的猪血清和患者血清,在相对分子质量(Mr) 35 000处有一清晰条带,表明其具有免疫反应性.结论 牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达.
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我国西部4地牛带绦虫成虫的形态学观察
目的 比较观察贵州省都匀、从江、新疆乌什和两藏拉萨等4地牛带绦虫成虫的形态学特征.方法 分别测量采自都匀(42条)、从江(41条)、乌什(7条)和拉萨(18条)等4地完整牛带绦虫成虫的长度,计数链体节片数,并采用整体染色封制法观察头节、成节和孕节的形态结构,进行显微测量、计数和摄影.结果 都匀的成虫平均长为(1.81±0.69)m,显著短于从江的(3.84±1.32)m、、乌什的(2.76±0.86)m和拉萨的(3.72±1.12)m成虫(P＜0.05).都匀成虫的链体平均节片数为(574.64±189.33),也显著少于从江的(913.84±317.41)、乌什的(971.29±168.30)和拉萨的(940.38±368.26)(P＜0.05).都匀牛带绦虫成节的排泄管间距与卵黄腺长度比值平均为(1.71±0.13),明显小于从江的(2.23±0.06)、乌什的(2.03±0.21)和拉萨的(2.31±0.15)比值(P＜0.05).染色观察都匀牛带绦虫10个头节中有3个明显可见发育不良的顶突.结论 都匀的牛带绦虫成虫形态特征与牛带绦虫亚洲亚种相似,而从江、乌什和拉萨等3地的牛带绦虫成虫形态特征与牛带绦虫指名亚种相似.
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我国4省9株牛带绦虫RAPD分子鉴别分析
目的 分别对4省9株牛带绦虫标本进行分子鉴别.方法 分别取台湾桃园株(TW1),贵州都匀株(DY1、DY2)、贵州从江株(CJ1、CJ2、CJ3、CJ4)、云南大理株(DL1)和新疆乌什株(XJ1)成虫节片,提取DNA,以13条随机引物进行PCR扩增,用随机扩增多态性DNA(RAPD)分析,并构建不同地理株系统发育树.结果 13条引物共扩增RAPD片段331个(以相同bp数为依据).单条引物扩增的RAPD片段数在3～28个之间,13条引物平均扩增RAPD片段在6.11～24.56个,平均14.15个;9个不同地理株牛带绦虫平均RAPD片段在9.85～16.62,平均14.08个.系统发育树显示:9个不同地理株牛带绦虫分为两支,DY1、DY2、DLI和TW1聚为一支,属于牛带绦虫亚洲亚种;CJ1、CJ2、CJ3、CJ4和XJ1聚为另一支,属牛带绦虫指名亚种.结论 我国4省9株牛带绦虫分别属于牛带绦虫亚洲亚种和牛带绦虫指名亚种.RAPD分析可用于区分牛带绦虫亚洲亚种与牛带绦虫指名亚种的分类学参考.
关键词： 牛带绦虫 牛带绦虫亚洲亚种 随机扩增多态性DNA(RAPD) -
用mtCOⅠ技术测定云南及贵州四地区的牛带绦虫
目的用mtCO Ⅰ技术鉴定云南省大理及贵州省都匀、从江等地所发现的是牛带绦虫或牛带绦虫亚洲亚种.方法采集成虫样本,抽提DNA,PCR扩增线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(mtCO Ⅰ)部分基因片段并测序,经PHYLIP软件包处理,计算遗传距离并构建系统发育树状图.结果云南省兰坪、大理和贵州省都匀的标本mtCO Ⅰ基因片段序列与已知牛带绦虫亚洲亚种的序列相同.贵州从江的标本mtCOⅠ基因片段序列与已知牛带绦虫的序列相同.两组基因片段的同源性达97.44%,氨基酸序列同源性达99.16%.系统发育树状图显示,牛带绦虫亚洲亚种和牛带绦虫为接近,远离猪带绦虫及其他绦虫.结论云南省兰坪、大理及贵州省都匀存在牛带绦虫亚洲亚种,贵州省从江发现的虫种为牛带绦虫.
关键词： 牛带绦虫 牛带绦虫亚洲亚种 线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ -
牛带绦虫亚洲亚种苹果酸脱氢酶基因的生物信息学分析
利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY)中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析工具,结合其他生物信息学分析软件包进行分析.牛带绦虫亚洲亚种苹果酸脱氢酶(MDH)基因是全长基因,长度为1 212 bp,编码区为30～1 028 bp,编码332个氨基酸,无跨膜区,具有多个磷酸化位点,蛋白理化性质稳定;预测3个主要的抗原表位(aa95～aa100、aa322～aa327和aa117～aa122)在MDH空间结构上相距较远的分子表面,aa117～aa122属于带绦虫共有的线性抗原表位.预测胞桨型苹果酸脱氢酶是一个潜在的诊断抗原.
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贵州都匀牛带绦虫亚洲亚种的调查和虫体内元素及氨基酸的检测
目的了解贵州省都匀市牛带绦虫病的流行因素及病原虫种,并对成虫体内氨基酸组分及元素进行检测.方法①对该市河阳乡的米秀村等6个村寨进行牛带绦虫病流行病学调查,对70名现症患者(男性67,女性3)的感染原因、临床症状进行了解分析并作驱虫治疗.②对驱出的成虫作形态学鉴定和测量.③采用氨基酸分析仪、原子吸收光谱仪及分子荧光仪等分别测定成虫体内游离氨基酸组分及各种元素的含量.结果①当地牛带绦虫感染主要是因群众喜吃生的或不熟的猪肝引起,患者的临床表现以排节片、肛门瘙痒、腹痛、腹泻等为主.70位有临床症状的成人中,有25人驱出成虫(男性24人,女性1人).②成虫外形与牛带绦虫极其相似,头节上无顶突及小钩;但虫体较短,大小在0.61～2.58 m之间,节片较薄而且数量少.③检测了成虫的16种氨基酸及12种元素.结论贵州省都匀有牛带绦虫病局部流行,患者的临床表现与传统的牛带绦虫病相似.根据感染原因和对虫体的测量结果,认为病原体应当是牛带绦虫亚洲亚种(Taenia saginata asiatica).
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贵州都匀、从江两地牛带绦虫感染家猪的比较研究
目的 通过两地牛带绦虫感染家猪,了解贵州省都匀是否存在牛带绦虫亚洲亚种.方法 对都匀、从江两地绦虫病患者进行驱虫,从孕节分离虫卵感染家猪,收集囊尾蚴并观察其特征.结果 两地牛带绦虫均可在家猪体内发育为囊尾蚴, 感染率分别为87.5%和62.5%.囊尾蚴回收率分别为0.266%和0.028%,囊尾蚴只分布在肝脏,并以肝实质为多见. 都匀囊尾蚴比从江的稍大,其外壁有小的疣状物,头节可见伸缩的顶突和两圈逗点样结构, 但无明显小钩.结论 ①家猪可作为两地牛带绦虫的中间宿主.②形态学研究显示都匀牛带绦虫是牛带绦虫亚洲亚种,而从江牛带绦虫是传统牛带绦虫.③贵州省都匀存在牛带绦虫亚洲亚种的局部流行病区.
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我国西部6省9地牛带绦虫rDNA-ITS1序列测定及分析
目的 利用分子生物学技术鉴定我国6省9地是否存在牛带绦虫亚洲亚种.方法 取成虫标本孕节2～3片,酚氯仿法提取DNA, PCR法扩增rDNA-ITS1片段, 并纯化、克隆此片段后作序列测定.利用BioEdit, clustalx, PHYLIP, Treeview软件处理后构建系统发育树.结果 广西融水(RS)、宾阳(BY)牛带绦虫标本与贵州都匀(DY), 云南大理(DL)牛带绦虫标本序列基本一致,同源性为98%～99%;新疆乌什(WS)、西藏拉萨(LS)、内蒙古(NM)、云南西双版纳(BN)牛带绦虫标本与贵州从江(CJ)牛带绦虫标本序列基本一致,同源性为98%～99%.系统发育树显示:RS、BY、DL和DY标本遗传距离较近;WS、LS、CJ、NM和BN标本遗传距离较近.而两组间遗传距离较远.结论 RS、BY、DL和DY四地存在牛带绦虫亚洲亚种; WS、LS、CJ、NM和BN五地存在传统牛带绦虫.
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我国4省区5地牛带绦虫rDNA-ITS2序列分析
目的 采用PCR克隆测序方法对贵州都匀、从江,云南大理及新疆乌什4地牛带绦虫标本进行研究,与台湾桃园牛带绦虫亚洲亚种地理株作比较,为贵州株、云南株和新疆株的鉴别提供分子生物学证据,并进一步探讨牛带绦虫亚洲亚种的分类学地位.方法 取贵州都匀株(DY1)、贵州从江株(CJ1),云南大理株(DL1),新疆乌什株(XJ1)和台湾桃园株(TW1)成虫节片,分别抽提DNA,PCR扩增rDNA-ITS2区段,克隆rDNA-ITS2区段后作序列分析,构建不同地理株系统发育树.结果 根据ITS2序列构建的系统发育树显示:系统发育树分为3支,XJ1占据上方1支;CJ1占据中间1支;而TW1、DY1和DL1组成下方1支.结论 1.DY1、DL1与TW1属于牛带绦虫亚洲亚种,CJ1、XJ1属于传统牛带绦虫;2.rDNA-ITS2序列分析可用于牛带绦虫亚洲亚种与传统带绦虫分类学之研究.
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牛带绦虫亚洲亚种感染乳猪肝脏的病理学和组织化学观察
目的: 观察牛带绦虫亚洲亚种感染乳猪后肝脏的病理学和组织化学改变.方法: 以牛带绦虫亚洲亚种虫卵感染乳猪,封闭饲养;采用HE染色及组织化学染色观察不同时期肝组织的病理学变化并测定脂肪、糖原、蛋白质的含量,定量图像分析和SPSS统计学处理.结果: 感染组感染4 d时,肝脏开始有炎性细胞浸润;10～20 d时,炎症反应加剧,Kupffer细胞增生,肝细胞水肿、部分气球样变,肝细胞有点片状坏死,中央静脉、肝血窦扩张和淤血;40～60 d时,肝脏肉芽肿形成,肝脏呈早期肝硬化改变;70～80 d时,部分肝脏呈肝硬化改变,胆管增生;感染不同时期均有不同程度脂肪含量的增多,糖原、蛋白质含量的减少,与正常对照组比较具有统计学意义(P＜0.01);对照组乳猪无感染.结论: 乳猪是牛带绦虫亚洲亚种的适宜中间宿主,牛带绦虫亚洲亚种感染可引起肝组织严重的病理学损害和组织化学改变.
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云贵两省三地牛带绦虫核糖体rDNA-ITS1序列分析
目的: 采用PCR克隆测序方法,对采自贵州省都匀、从江及云南省大理三地牛带绦虫,与台湾桃园牛带绦虫亚洲亚种标本进行比较,为贵州都匀、从江及云南大理牛带绦虫标本鉴别提供分子生物学证据,并进一步探讨牛带绦虫亚洲亚种分类学地位.方法: 取贵州都匀株、贵州从江株、云南大理株和台湾桃园株成虫节片,抽提DNA,PCR扩增rDNA-ITS1区段,克隆测序;结合GenBank中已知猪带绦虫rDNA-ITS1序列,构建系统发育树.结果: 贵州都匀、云南大理牛带绦虫标本、台湾牛带绦虫亚洲亚种标本的ITS1序列基本一致,同源性达98%～99%;贵州从江牛带绦虫标本ITS1序列与前三者有30个碱基差异,与台湾桃园、贵州都匀和云南大理同源性均为97%.系统发育树显示:贵州都匀和云南大理牛带绦虫标本与台湾牛带绦虫亚洲亚种标本的遗传距离接近,距贵州从江牛带绦虫标本较远,与猪带绦虫则更远.结论: (1)贵州都匀和云南大理牛带绦虫标本属于牛带绦虫亚洲亚种,贵州从江牛带绦虫标本属于传统牛带绦虫.(2)rDNA-ITS1序列分析可以用于牛带绦虫亚洲亚种与传统带绦虫分类学研究.
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贵州都匀牛带绦虫亚洲亚种的流行病学调查
目的: 了解贵州省都匀市河阳乡牛带绦虫病的流行因素及病原虫种,为防治措施的制定提供依据.方法: 对该市河阳乡米秀村等7个村寨进行牛带绦虫病流行病学调查,对106例现症病人(男95例,女11例)的感染原因、临床症状进行分析并作驱虫治疗;对驱出的成虫作形态学鉴定和测量.结果: 当地牛带绦虫感染主要是因群众喜吃生的或不熟的猪肝引起,患者的临床表现以排节片、肛门搔痒、腹痛、腹泻等为主;106例有临床症状的成人中,有37例驱出成虫(男35例,女2例);成虫外形与牛带绦虫极其相似,头节上无顶突及小钩.虫体较短,大小在0.61～4.19 m.节片较薄而且数量少(链体节片数:232～828),孕节子宫分支数每侧为17～28支.结论: 贵州省都匀有牛带绦虫病局部流行,患者的感染方式以及感染虫体的形态与牛带绦虫亚洲亚种相似.
