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基于matK序列的积雪草与其易混品的分子鉴定方法分析
目的:积雪草容易与多种混淆品相互混淆,本研究拟基于matK序列探讨积雪草与其混淆品鉴定的新方法.方法:从GenBank核酸数据库下载积雪草、过路黄、连钱草和乌蔹莓的matK序列,应用ClustalX 2.1软件进行SNP鉴别位点分析,应用MEGA5.0软件计算种内种间(K2P)遗传距离和构建邻接(NJ)系统聚类树.结果:获得积雪苹与过路黄各5个matK序列及连钱草和乌蔹莓各1个matK序列,分析显示积雪草与其混伪品的matK序列存在较大差异,具有近百个SNP位点,且其中多是积雪草特有的,可用于分子鉴定.且积雪草大种内K2P遗传距离0.001,远远小于其与混伪品的种间K2P遗传距离0.242 ～0.293,构建的系统发育树显示积雪草与其混淆品可明显分开.结论:综合以上分析,matK序列为鉴定积雪草及其混淆品提供了新的分子鉴定方法.
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基于形态和DNA序列分析的海龙类药材商品的基原调查
目的:为市售海龙药材的鉴别以及建立质量控制标准提供科学依据.方法:对我国主要药材市场的海龙类商品进行收集,并通过形态鉴别和DNA分子鉴别确定海龙商品基原.结果:共有刁海龙Solenognathus hardwickii(Gray,1830)、拟海龙Syngnathoides biaculeatus(Bloch,1785)、舒氏海龙 Syngnathus schlegeli Kaup,1856、宝珈枪吻海龙 Doryichthys boaja (Bleeker,1850)、黑斑刁海龙Solegnathus lettiensis Bleeker,1860、斗氏刁海龙Solegnathus dunckeri Whitley,1927、多棘刁海龙Solegnathus spinosissimus Günther,1870、粗吻海龙Trachyrhamphus serratus(Temminck et Schlegel,1847)、光粗吻海龙Trachyrh-amphus bicoarctatus(Bleeker,1857)、长吻粗吻海龙 Trachyrhamphus longirostris Kaup,1856、葛氏海蠋鱼 Halicampus grayi Kaup,1856等11种基原,其中黑斑刁海龙、斗氏刁海龙、光粗吻海龙、长吻粗吻海龙为首次在中药市场中发现.结论:本文所进行的DNA序列分析结合形态鉴别方法也对其他中药材的市场调查和商品基原鉴别研究提供了模式.
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常用蛇类药材鉴别研究进展
蛇是人类宝贵的野生动物资源,也是我国重要的蛇类药材来源.它具有祛风、通络、定惊止痉等功效,在风湿痹证方面具有良好的治疗效果.近年来,在经济利益驱使下,加上我国蛇种类繁多,现有蛇类多达241种,且各自形态特征差异不明显,使得准确鉴定药材困难,容易导致市场用药品种混乱.文章就近10年来用于常用蛇类药材(主要以《中国药典》收载品种乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇为例)及其混伪品的鉴别方法进行了整理研究,综述了各类鉴别方法在蛇类药材中的研究进展,包括传统的性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别及近年来发展的微性状鉴别、色谱质谱技术和一些现代的分子鉴别方法如DNA条形码技术,并阐述了各种鉴别方法的适用对象及其优缺点,以期为蛇类药材或者动物类药材的鉴别研究提供思路和参考.发现目前药用蛇在现场快检、中成药的鉴别和优劣鉴别方面仍然面临着一些困难,提示对药用蛇品质进行客观评价时,还需将传统与现代鉴别方法相结合、真伪与优劣鉴别技术相联系.
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多重位点特异性PCR鉴别海龙及其混伪品
目的:建立一种高效、准确的中药材海龙及其常见混伪品的特异性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴别方法.方法:通过比较海龙及其混伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(cytochrome C oxidase subunit Ⅰ,COⅠ)基因序列差异,根据变异位点设计刁海龙、尖海龙及拟海龙的特异性鉴别引物,优化反应体系,并对此方法进行耐受性和适用性的考察和验证.在此基础上,将3对特异性引物组合,构建多重PCR体系.结果:在多重PCR体系中,刁海龙能扩增出485 bp片段,尖海龙可扩增出120 bp片段,拟海龙可以扩增出240 bp片段,其他混伪品均无条带.所设计的特异性鉴别引物具有高度的特异性.结论:该文所建立的位点特异性PCR鉴别方法可实现海龙的准确鉴别.
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我国不同地区白木香核糖体DNA内转录间隔区碱基序列分析
目的:研究我国不同地区白木香核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)碱基序列的差异.方法:运用PCR法对白木香的ITS(包括ITS1,5.8S,ITS2)序列扩增后直接测序,用软件CLUSTAL X和MEGA分析测序结果.结果:白木香ITS区总长度为680bp,其中ITS1为246bp,5.8S为163bp,ITS2为271bp.ITS序列在白木香种内的变异很小,只有6个变异位点,种内遗传距离为0.0%-1.1%.结论:ITS序列的差异为鉴别不同产区白木香及其近缘种提供了依据.
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基于ITS2序列的吴茱萸属植物亲缘关系及分子鉴别研究
目的:研究吴茱萸药材3种不同基原植物及伪品楝叶吴茱萸的亲缘关系和真伪鉴别.方法:采用DNA条形码技术,对ITS2区段进行PCR扩增和测序,使用MEGA 5.1软件计算种内、种间Kimura-2-parameter遗传距离,采用邻接(NJ)法构建其系统发育树.使用DNAstar 5.0软件比对特异性位点.结果:4个物种共18个样本的ITS2序列长度均为220bp,产生了17个单核苷酸多态性位点,其中特异性位点7个;正品吴茱萸药材的3种基原植物种内大遗传距离为0.023,种间遗传距离为0.036-0.039,与楝叶吴茱萸的小种间遗传距离为0.042; NJ系统发育树表明:基于ITS2序列聚类的吴茱萸基原植物可与楝叶吴茱萸有效区分,3种基原植物同一品种样本优先聚类,其次是同一产区聚类.结论:ITS2 DNA条形码可以准确有效地用于吴茱萸属植物亲缘关系研究和真伪品的鉴别.
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松果菊属3种药用植物的DNA分子鉴别研究
目的:对松果菊属3种药用植物进行DNA指纹图谱鉴别,筛选出稳定的鉴别引物.方法:RAPD.结果:共筛选随机引物160个,3种松果菊中,狭叶松果菊与淡紫松果菊的RAPD图谱极其相似,难以区分.终仅筛选得到一个可用于鉴别的随机引物H07.结论:引物H07可用于3种松果菊的原植物与药材鉴别,狭叶松果菊与淡紫松果菊具有明显较近的亲缘关系.
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天花粉药材及其类似品的分子鉴别新方法
目的:寻找天花粉类药材快捷准确的分子鉴别方法.方法:在天花粉ITS保守区域设计3个20 mer左右单引物,对19批天花粉商品及其9种伪品进行PCR扩增.结果:引物TkS1-64得到天花粉及其伪品的DNA多态性图谱,其中560 bp和960 bp条带为天花粉的特征鉴别条带.结论:引物TkS1-64具有稳定性好、重复性高的优点,可以作为天花粉类药材分子鉴别引物.此方法定名为锚定引物扩增多态性DNA(anchored primer amplificationpllymorphism DNA,简称APAPD),在中药材鉴别中具有推广应用的价值.
关键词： 天花粉 类似品 分子鉴别 锚定引物扩增多态性DNA -
石蒜属叶绿体trnL-F序列的变异与系统聚类分析
目的:分析比较石蒜属和近缘属植物中国水仙trnL基因的部分序列和trnL-trnF间隔区的完整序列,为石蒜属物种鉴别和种间亲缘关系分析提供分子佐证.方法:采用PCR产物直接双向测序法,用Clustal X 1.81,MEGA 2.0软件进行序列分析,采用大简约法(maximum parsimony,MP)构建系统发育树.结果:所测物种的序列全长在905～1 036 bp,经排序后,两端切平,得到886 bp的整齐序列,所测物种的核苷酸变异位点14个,信息位点10个,主要在trnL内含子区,这些位点可用于区分石蒜属物种;4个碱基"ATAT"缺失/插入是区别石蒜属与其近缘植物水仙的显著特征.重建的系统发育树表明:供试的石蒜属物种聚成3类,除稻草石蒜、忽地笑、香石蒜的系统位置有所不同之外,与经典分类结果基本相符.水仙属2个种形成1个单系类群,表明属间trnL-F序列差异明显.结论:分子系统树支持安徽石蒜是长筒石蒜的变种或杂交种观点,换锦花可能是玫瑰石蒜、红蓝石蒜的杂交母本.石蒜属种间trnL-F序列存在一定变异,是物种鉴别的有效分子标记.
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绞股蓝属植物及其混淆品乌蔹莓的PCR-RFLP鉴别研究
目的:寻找简便、可重复的分子标记方法对绞股蓝属Gynostemma植物及其混淆品乌蔹莓Cayratia japonica进行鉴别.方法:对7种常见药用绞股蓝属植物及其混淆品乌蔹莓的6个cpDNA片段进行PCR扩增,再利用Taq Ⅰ,HpaⅡ,EcoR Ⅰ,Rsa Ⅰ,Hha Ⅰ,HindⅢ等6种限制性内切酶分别对扩增片段进行消化.结果:36种DNA片段/内切酶组合中,trnK1f-tmK2r片段与RsaⅠ组合可将乌蔹莓从绞股蓝属植物中区分出来,产物清晰、结果稳定.结论:PCR-RFLP分析方法可有效区分常见绞股蓝属植物与其混淆品乌蔹莓.
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基于ITS序列鉴别石斛类药材
获得高质量的DNA是中药石斛分子鉴别的关键所在.研究比较DNA提取方法(试剂盒提取、CTAB法),从石斛类药材中提取可用于PCR扩增的基因组DNA,基于ITS序列分析进行药材基原鉴别.结果表明,采用改良CTAB法(大量提取),从22批石斛类药材中富集并提取到基因组DNA,通过克隆测序获得ITS序列,同研究积累的石斛属植物ITS序列资料与Genbank序列数据库进行比对分析,根据序列相似性程度从12批黄草药材中鉴定石斛14种,近似种5种;从10批枫斗中鉴定石斛6种,近似种3种.该方法弥补了传统生药学鉴定方法在石斛类药材鉴别上的局限性,具有一定的应用前景.
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基于荧光测序分型技术的六味地黄丸原料分子鉴别研究
该文选择成药六味地黄丸为研究对象,建立了一种用于中成药原料药材基原鉴定的荧光测序分型技术.首先以原料药材丹皮DNA为模板,筛选适荧光标记鉴别引物,即通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别对5个FAM荧光标记引物sbA-trnH,ITS,trnL-trnF,matK,rbcL序列进行扩增,并对扩增产物进行测序,所得测序结果使用Gene-Marker V1.80进行分析.根据分析结果终选择sbA-trnH荧光标记引物来鉴别六味地黄丸及其原料药材.结果表明,通过psbA-trnH荧光标记引物扩增分析,可以准确鉴定出六味地黄丸中的丹皮,山药,泽泻3种原料药材.研究结果说明,采用分子荧光测序分型技术鉴定中成药原料具有一定的可行性.
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蒙成药中“地格达”类原料药材的位点特异性PCR鉴别研究
该文选择8种含有地格达类蒙药原料药材的蒙成药为对象,首先对基原植物肋柱花和苦地丁样品采用改良CTAB法提取其总DNA,使用sb A-trnH片段进行扩增、测序,与GenBank下载的8种蒙成药中其他原料药材sb A-trnH序列进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物.同时对8种蒙成药进行总DNA的提取,并使用DNA纯化试剂盒进行纯化,通过PCR反应对叶绿体rbcL序列进行扩增,再分别选择肋柱花和苦地丁鉴别引物进行扩增,并将扩增后的产物进行测序.所得序列校正、比对后,进行比对分析.结果表明,地格达-4汤、地格达-8散、地格达-4散中均含有原料药材肋柱花,苦地丁特异鉴别引物扩增分析可以鉴定出利胆八味散、伊赫哈日-12和阿嘎日-35中含有苦地丁.该研究结果说明,位点特异PCR方法用于鉴定蒙成药中原料药材具有一定的可行性.
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我国辽宁省赫坎按蚊种团的分子鉴别研究
为更新和补充辽宁省按蚊多样性的本底资料,笔者对2008年在辽宁省5个地点采集的按蚊进行形态和PCR分子鉴别,并随机抽取已鉴别的和未获鉴别的样本,进行rDNA-ITS2序列测定和分析.本研究共鉴别了168个个体,均为赫坎按蚊种团成员种,分别是中华按蚊(n=14)、雷氏按蚊(n=4)、八代按蚊(n=113)、比伦按蚊(n=2)和克莱按蚊(n=35).
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PCR-RFLP鉴别微小按蚊亲缘种A和C
目的建立微小按蚊复合体不同亲缘种A和C的分子鉴别方法-PCR产物酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP). 方法用单蚊蚊腿消化提取基因组DNA,PCR特异扩增核糖体28S第3结构域 (D3)基因,对PCR产物进行纯化、克隆和测序;分析微小按蚊A和C D3基因的酶切图谱,选择合适的限制性内切酶对两者PCR产物进行特异性切割, 按照酶切片段长度区分两亲缘种. 结果微小按蚊A被限制性内切酶 MboII切割后在约376 bp、268 bp和108 bp处出现3条条带,而微小按蚊C因第96 bp、97 bp位点突变,不存在限制性内切酶 MboII的特异识别位点而未被消化,仅在376 bp处存在唯一条带. 结论本实验建立的PCR-RFLP分子鉴别方法能有效地将形态难以鉴别的微小按蚊亲缘种A和C(GenBank: AF416782, AF415594)区分开来.
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云南、贵州两省38条人体带绦虫的分子鉴别
目的 对采自云南、贵州两省的38条人体带绦虫进行分子鉴别,了解当地猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫的分布状况. 方法对云南大理和贵州都匀及从江地区有排节片史的病人以槟榔-南瓜子法驱虫,虫体经形态学初步鉴别后,以组织DNA提取试剂盒提取虫体基因组DNA,分别采用亚洲带绦虫、牛带绦虫和猪带绦虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1基因(cox1)片段的特异性引物对各DNA样品进行常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测;PCR阴性样品采用带绦虫cox1片段PCR通用引物进行扩增,并选择1份亚洲带绦虫特异性PCR阳性的样品作为对照.从3种带绦虫PCR阳性的扩增产物中各选择1份进行核酸序列测定,并用NCBI Blast将各核酸序列与GenBank数据库中带绦虫的cox1进行比对分析. 结果采自大理的4条带绦虫(DL1～4)的猪带绦虫cox1片段PCR为阳性,扩增产物约980 bp;其余25条大理带绦虫(DL5～29)和5条都匀带绦虫(DY1～5)的亚洲带绦虫cox1片段PCR为阳性,扩增产物约260 bp;各样品的牛带绦虫cox1片段PCR均为阴性.DL2 PCR产物的核酸序列与GenBank中猪带绦虫cox1的同源性为99%～100%,DY1 PCR产物的核酸序列与亚洲带绦虫cox1的同源性为100%.特异性PCR均阴性的4条从江带绦虫(CJ1～4)和哑洲带绦虫特异性PCR阳性的DL7以带绦虫cox1片段通用引物的PCR扩增出约1 kb的产物.测序表明,CJ1片段的核酸序列与牛带绦虫cox1的同源性为99%,DL7与亚洲带绦虫cox1的同源性为99%～100%. 结论cox1片段PCR扩增和核酸测序分析表明,采集的云南大理人体带绦虫为猪带绦虫和亚洲带绦虫,贵州都匀和从江人体带绦虫分别为亚洲带绦虫和牛带绦虫.
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山东省赫坎按蚊复合体成员种的分子鉴别研究
目的进一步确认山东省赫坎按蚊复合体成员种. 方法采用鉴别PCR方法,对采自山东省8个地点经形态学初步鉴定的645只蚊虫进行检测,并对已检测的标本随机抽取数个样本,进行rDNA-ITS2序列测定. 结果 645份样本中,中华按蚊占90.85%(586/645)、雷氏按蚊占5.27%(34/645),无扩增条带的标本占3.88%(25/645).测定已鉴别的山东省中华按蚊、雷氏按蚊的ITS2序列长度分别为469 bp和451 bp, 经Blast比对分析,显示与已公布的序列完全相同;3份无扩增条带标本的序列经核对为库蚊. 结论山东省分布的赫坎按蚊复合体成员种主要为中华按蚊、雷氏按蚊,其它成员种有待进一步证实.
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核糖体28S-D3等位基因特异扩增鉴别微小按蚊亲缘种A和C
目的建立微小按蚊复合体不同亲缘种A和C的分子鉴别方法.方法用单蚊蚊腿消化提取基因组DNA,PCR特异扩增28S第3结构域(D3)基因,对PCR产物进行纯化、克隆、测序和序列分析;基于序列差异设计特异引物,进行等位基因特异扩增(PCR-ASA),根据扩增片段大小区分微小按蚊不同亲缘种.结果发现微小按蚊不同亲缘种A和C(GeneBank登录号:AF416782,AF425594), 根据二者序列差异设计的特异引物能在普通琼脂糖凝胶上直观地区分两亲缘种,两者除在376 bp处有一共同条带外,分别在294 bp和112 bp处出现各自的特异扩增带.结论我们建立的ASA分子鉴别方法能有效地将我国微小按蚊不同亲缘种A和C区分开来.
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中国部分地区赫坎按蚊种团的分子鉴别研究
目的 阐明我国各地赫坎按蚊种团成员种的组成.方法 依据形态鉴定赫坎按蚊种团成员,种类应用PCR法和分子特征确认,分析的分子特征为rDNA-ITS2和rDNA-28S-D3序列.结果 对采自我国12个省20个地点的按蚊样本(n=1259)进行分子鉴别结果显示,该研究样本中包括赫坎按蚊种团成员种(n=1237)和其它按蚊3种(n=22)；其中赫坎按蚊种团的成员种为中华按蚊、雷氏按蚊、八代按蚊、贵阳按蚊、筠连按蚊、克莱按蚊、比伦按蚊,以及3个未定名种(LL1、LL2和LL3)；中华按蚊在大多数采集点密度大.结论 赫坎按蚊种团非常复杂,综合分析确定其成员种类和分布非常重要.
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枫斗类石斛cpDNA psbA-trnH的序列分析与鉴别
本研究对常见枫斗类石斛cpDNA的psbA-trnH区进行了测序,利用MEGA 4.0对该区序列进行了比较分析.结果显示:15种常见的枫斗类石斛的psbA-trnH序列长度为721～767 bp,变异位点42个,简约信息位点11个.以Kimura-2参数计算遗传距离,常见枫斗类石斛的种间遗传距离为0.001 3～0.018 3,平均遗传距离为0.014 8.不同石斛种间均存在序列差异,全序列中共出现6处indels,导致种间片段长度差异较大;暂未发现所检测的枫斗类石斛居群间在psbA-trnH区的序列存在差异.利用枫斗类石斛psbA-trnH序列数据库及遗传分析软件,通过对待检种的psbA-trnH序列的测定,成功鉴别了待检种.cpDNA的psbA-trnH区可作为枫斗类石斛分子鉴别的候选标记.
