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羚羊角塞特异性PCR鉴别方法研究
目的:为解决中药羚羊角塞与羚羊角相比因失去"通天眼"等传统鉴别特征而鉴别困难的问题,建立准确鉴别鉴定羚羊角塞的方法.方法:通过比对羚羊角塞基原动物赛加羚羊与其7种常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I(Cyto-chrome coxidase I,COI)序列,根据差异位点设计出仅扩增赛加羚羊DNA的特异性鉴别引物.结果:进行PCR时,当退火温度为64 ℃,循环数为33个时,仅羚羊角塞正品扩增获得约300 bp大小的条带,混伪品无条带.结论:该方法可作为准确有效检测待检样品是否来源于赛加羚羊的方法,用于羚羊角类样品的DNA鉴别.
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多重位点特异性PCR鉴别海龙及其混伪品
目的:建立一种高效、准确的中药材海龙及其常见混伪品的特异性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴别方法.方法:通过比较海龙及其混伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(cytochrome C oxidase subunit Ⅰ,COⅠ)基因序列差异,根据变异位点设计刁海龙、尖海龙及拟海龙的特异性鉴别引物,优化反应体系,并对此方法进行耐受性和适用性的考察和验证.在此基础上,将3对特异性引物组合,构建多重PCR体系.结果:在多重PCR体系中,刁海龙能扩增出485 bp片段,尖海龙可扩增出120 bp片段,拟海龙可以扩增出240 bp片段,其他混伪品均无条带.所设计的特异性鉴别引物具有高度的特异性.结论:该文所建立的位点特异性PCR鉴别方法可实现海龙的准确鉴别.
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草珊瑚与金粟兰叶片双位点特异性PCR鉴别方法研究
筛选获得草珊瑚与金粟兰鉴别的特异位点并建立双位点特异性PCR方法,用于鉴别草珊瑚与金粟兰叶片以及两者的混杂品.采集不同产地的草珊瑚18份、金粟兰6份,所有样品提取总DNA,并对草珊瑚与金粟兰干燥叶片进行DNA提取.通过对其ITS片段进行扩增、测序,并搜索GenBank数据库中收录的草珊瑚与金粟兰的ITS序列,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物,构建多重PCR体系,并优化PCR条件,对草珊瑚与金粟兰叶片进行快速分子鉴定.构建了多重PCR鉴别体系,只经一个PCR反应,能扩增出草珊瑚580 bp的特异性鉴别条带及金粟兰470 bp的特异性片段,可快速鉴别草珊瑚与金粟兰叶片,并可判断相互是否混杂.使用双位点特异性PCR技术可以有效快速鉴别草珊瑚与金粟兰叶片,并可判断相互是否混杂.
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基于ITS2序列SNP位点鉴定白及药材及其混伪品
为建立白及药材的分子标记鉴定方法,该文提取白及及其混伪品药材的基因组DNA,利用PCR技术扩增rDNA ITS2片段,片段经双向测序、排序、比对,构建邻接树,查找SNP位点.结果显示,ITS2序列不仅能够有效地区分白及与其混伪品,而且存在可用作白及、黄花白及与其混伪药材鉴别的SNP位点.针对标记白及药材的SNP位点设计引物,通过筛选引物和优化特异性扩增条件后,获取引物BJ59-412F,BJ59-412 R, HH BJ-225R在同一扩增条件下,可有效扩增白及、黄花白及,其产物长度分别约为350,520 bp,而混伪品则无PCR条带产生.该文所述引物和建立的反应条件可成功将白及、黄花白及与其混伪品药材进行同步鉴定,操作快速、简捷,结果可靠,可作为白及药材的快速分子鉴定方法.
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断肠草与金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究
目的:研究断肠草与金银花类药材水提液的DNA分子鉴别方法.方法:采集不同产地的断肠草药材13份、金银花32份、山银花21份和水银花5份,所有样品提取总DNA,并对断肠草、金银花、山银花的水提液进行DNA提取.通过对断肠草ps-M-trnH片段进行扩增、测序,并搜索GenBank数据库中收录的中金银花类药材基原植物psbA-trnH序列,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物.结果:通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现断肠草可扩增出97 bp片段,而金银花类药材则不能扩增出条带.结论:通过特异性PCR的方法实现了断肠草与金银花类药材水提液的快速、准确鉴别.
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太子参药材的快速分子鉴定
为建立一种简便快捷的太子参分子鉴定方法,对太子参药材及其混伪品的rDNA-ITS片段进行比对分析,找出特异性片段,设计太子参鉴别引物,并优选扩增条件,扩增产物经100×SYBR Green Ⅰ染色后紫外光下观察.结果显示,PCR扩增反应液(包括DNA Taq聚合酶预混液5.5 μL,Tzs-2F,Tzs-2R各10 pmol,DNA模板20～ 80 ng,双重灭菌蒸馏水加至25μL)经95℃预变性1 min,95℃变性5 s,56℃退火延伸15 s,30个循环,72℃后延伸30 s后,在扩增产物中加入1μL100×SYBR Green Ⅰ混匀后于紫外光下呈绿色荧光的为太子参,混伪品无绿色荧光出现.40 min内即可完成DNA提取、扩增等整个鉴定过程.该方法能特异性扩增太子参DNA,紫外光下肉眼观察即可鉴定药材的真伪,且操作简捷、结果准确、利于推广,可为快速鉴定中药材的真伪提供参考.
关键词： 太子参 分子鉴定 特异性PCR SYBR Green Ⅰ -
特异性PCR方法鉴别鳖甲药材和饮片
鳖甲为临床常用的动物药材,炮制加工后鳖甲药材及饮片形态特征丢失,难以鉴别.为建立高效稳定的鳖甲DNA鉴别方法,该研究将SDS法与柱纯化相结合,使用通用引物进行PCR扩增和测序,并根据鳖甲及其混伪品序列差异,寻找特异性SNP位点设计了鉴别引物,对PCR反应条件进行优化,并进行适用性及准确性考察.当退火温度为62℃,循环次数为35,使用设计的鳖甲特异性鉴别引物Biejia-272.F/R进行PCR扩增,鳖甲药材、饮片及醋鳖甲均扩增获得约300 bp的特异性鉴别条带,混伪品无条带.该方法可作为一种快速准确鉴别鳖甲正伪品的鉴定方法.
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绵羊肺腺瘤病特异性PCR及套式PCR诊断方法的建立
绵羊肺腺瘤是由外源性反转录病毒JSRV引起的接触性传染的肺肿瘤性疾病.感染羊没有针对JSRV的循环抗体,但在感染羊的肺肿瘤组织、淋巴网状系统及外周血单核细胞中可检测到外源性前病毒exJSRV及JSRV转录产物.健康羊基因组中存在15～20拷贝的内源性前病毒enJSRV,内外源性前病毒的结构基因高度相似,而在U3区存在差别,因而,设计了针对exJSRVU3区的特异性引物并在国内首次建立了一步法特异性PCR检测法及套式PCR检测法.以700ng健康羊基因组DNA为背景,梯度稀释阳性质粒pJSRV-LTR作为模板,比较两种方法的敏感性,结果表明套式法的敏感性是一步法的10倍以上,套式法也是目前可用于检测感染羊血液样品的唯一方法,可望在绵羊肺腺瘤病的流行病学调查及防控方面起重要作用.
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甲基化特异性PCR法和限制性内切酶-PCR法检测脑胶质瘤hMLM1基因启动子区甲基化
目的研究脑胶质瘤中hMLM1基因启动子区的甲基化状态,并比较不同的甲基化检测方法.方法采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)法和限制性内切酶-PCR法,检测42例脑胶质瘤和5例正常脑组织中hMLM1基因启动子区的甲基化状态.结果用MSP法和限制性内切酶-PCR法检测,hMLM1启动子区甲基化率分别为4.8%(2/42)和11.9%(5/42),启动子区甲基化与性别、年龄、病理类型和病理分级无明显的相关性.结论在脑胶质瘤中hMLM1基因启动子区甲基化少见,MSP法和限制性内切酶-PCR法是简单、灵敏的甲基化检测方法.
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光慈菇药材的特异性PCR鉴定
目的:研究光慈菇基原植物老鸦瓣及其混伪品特异性PCR鉴定的可行性.方法:基于ITS序列构建光慈菇及其混伪品的系统发育树,并在对ITS序列分析的基础上,为光慈菇设计了一对特异性PCR引物LYB-CP2s/LYB-CP2a,优选扩增条件,用于区别光慈菇及其混伪品.结果:在系统发育树中光慈菇聚类为一个单系.通过对PCR反应的退火温度、循环次数和DNA模板用量进行优化,并对不同型号的PCR仪和Taq酶进行考察,分别获得光慈菇的特异性PCR反应程序.在PCR产物中,正品出现目的条带,而混淆品不出现条带.结论:特异性PCR鉴别方法稳定性高,能够有效地区别光慈菇与其混伪品.
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CpG岛甲基化检测方法
目的：建立CpC岛甲基化测定方法。方法：收集20例急性粒细胞性白血病(AML)，18例多发性骨髓瘤(MM),14例骨髓异常增生综合征(MDS),15例慢性粒细胞性白血病(CML)及20例正常对照组的外周血，分离单个核细胞，提取DNA，应用CpG岛甲基化特异的方法(MSP-PCR)，测定P15和P16基因甲基化情况。结果：P15和P16基因甲基化在各种白血病的表达率分别为AML 80％和70％；MM 72.2％和66.7％；MDS 57.1％和50％；CML 0％。结论：P15及P16基因甲基化在AML，MM及MDS中有较高表达，而在CML中不表达。
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高分辨熔解曲线分析慢性骨髓增殖性疾病JAK2V617F基因突变
目的 研究慢性骨髓增殖性疾病(CMPDs)获得性JAK2V617F突变检测方法.方法 应用高分辨熔解曲线分析技术(HRM),对前期经等位基因特异性PCR法(AS-PCR)分析过的36倒CMPDs样本进行JAK2V617F基因突变检测,并与AS-PCR检测情况进行比较分析,结果经测序验证.结果 36例CMPDs样本均得到可供分析的JAK2V617F基因突变HRM检测结果,与AS-PCR法相比较,二者的符合率为97%(35/36);只有一份样本结果不相符,经测序验证,结果与HRM检测相一致;HRM检测的敏感性和特异性均达100%.结论 应用HRM技术检测JAK2V617F突变快速简便、而且敏感,是一项适合临床开展的新方法,可用于临床辅助CMPDs的诊断.
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FHIT基因与HPV联合检测对宫颈癌诊断的意义
目的 通过检测宫颈癌患者DNA中脆性组氨酸三联体基因异常甲基化以及高危人乳头瘤病毒,以探讨二者联合检测在宫颈癌诊断中的意义.方法 采用巢式甲基化特异性PCR方法检测21例宫颈癌患者脆性组氨酸三联体基因的甲基化状态,同时应用HC2法测定高危人乳头瘤病毒,并与32例宫颈上皮内瘤变患者和25例健康者作对照,分析二者联合应用的临床诊断价值.结果 在13例宫颈癌患者标本检测到了脆性组氨酸三联体基因的甲基化,阳性率为66.7%,高危人乳头瘤病毒的阳性率为90.5%;平行联合检测时敏感性增至95.0%.宫颈上皮内瘤变组中脆性组氨酸三联体基因甲基化与高危人乳头瘤病毒阳性率分别为3.1%和28.1%;健康对照者标本中脆性组氨酸三联体基因无异常甲基化,高危人乳头瘤病毒阳性率为12.0%.结论 联合检测患者脆性组氨酸三联体基因甲基化与高危人乳头瘤病毒可提高宫颈癌诊断的敏感性和特异性,对于宫颈癌的早期诊断具有积极意义.
关键词： 宫颈癌 脆性组氨酸三联体基因 甲基化 高危人乳头瘤病毒 特异性PCR
