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犬贾第虫端粒重复序列的Southern印迹杂交分析
目的 确定犬贾第虫端粒DNA的重复序列,为进行端粒酶活性检测奠定基础. 方法 根据已发表的蓝氏贾第虫的端粒重复序列5'-TAGGG-3'设计寡聚核苷酸探针(TAGGG)5,并以地高辛标记,将犬贾第虫基因组DNA经Bal 31-EcoRⅠ酶切后,进行Southern印迹杂交分析. 结果 犬贾第虫基因组DNA与探针(TAGGG)5杂交,获得了较好的杂交条带,随Bal 31酶切时间的延长,杂交信号逐渐减弱. 结论 犬贾第虫端粒重复序列定位在染色体的末端序列与国外报道的贾第虫端粒重复序列一致,为5'-TAGGG-3'.
关键词： 犬贾第虫 端粒DNA Southern印迹杂交 -
犬贾第虫端粒酶催化亚基基因的克隆及序列分析
目的 对犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因进行克隆及序列分析. 方法 根据人源贾第虫的端粒酶催化亚基TERT基因(AF195121)设计1对引物,以犬贾第虫滋养体总核酸为模板,扩增犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因,PCR产物连接到PGEM-T载体并转化入DH5α感受态菌进行测序,通过BLAST对GenBank进行同源性搜索,并用分子生物学软件进行分析. 结果 测得犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因全长2 883 bp,该基因序列与人源贾第虫的端粒酶催化亚基基因同源性为99%,氨基酸的同源性也为99%. 结论 成功扩增了犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因,为进一步研究该基因的功能及筛选抗犬贾第虫药物靶标奠定了基础.
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犬贾第虫包囊排出规律的研究
目的 对自然感染贾第虫的比格犬进行粪检调查，结果表明犬贾第虫包囊排出呈间歇性，其间歇期为7～8天，排囊后12～14天达到排囊高峰期，峰期持续2～3天，排囊持续时间为25～27天。用2只幼犬进行免疫的抑制接种犬贾第虫，接种后第7天出现排包囊，排囊后6～7天达到排囊高峰期，高峰期持续4～5天。受染动物出现腹泻，体重减轻。
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犬贾第虫纯培养的建立
将取自一1岁自然感染犬贾第虫的雌性、德国牧羊犬的包囊利用蔗糖密度梯度离心-G1耐酸漏斗滤过法进行分离和纯化,经口感染给10日龄的沙鼠幼鼠,8 d后无菌取其小肠上段,分离出滋养体,转入改良TYS-I-33培养基中进行培养,在驯化5个月之后,虫体逐渐适应了培养环境,在管壁上形成了细胞单层并进行传代,每隔48～72 h传代1次,共传18代.将培养物置肉汤及血琼脂平板培养,未见细菌及霉菌污染,为纯培养.
关键词： 犬贾第虫 纯培养 改良TYI-S-33培养基 -
犬贾第虫核糖体16sRNA部分序列克隆及测定
目的获取犬贾第虫核糖体16sRNA基因序列.方法从犬贾第虫包囊中,快速提取DNA,并以DNA为模板,利用热启动PCR技术扩增出一611bp的预计大小的基因片段,纯化回收后,与PMD18-T载体连接转化到DH5a大肠杆菌中, 筛选到阳性克隆经PCR、EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,并用双脱氧链末端终止法测定DNA序列,登陆BLAST进行同源性比较和分析.结果获得了长度为611bp的基因序列,并发现与犬贾第虫核糖体的同源性高达99%.结论获得了犬贾第虫核糖体16sRNA的部分基因序列,为研究其在核酸进化领域中的地位和PCR法快速诊断贾第虫病提供了理想的基因材料.
