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美洲钩虫广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂NaKuI3的鉴定及特性研究
目的 原核表达美洲钩虫(Necator americanus)丝氨酸蛋白酶抑制剂NaKuI3,检测其对丝氨酸蛋白酶的抑制活性. 方法 根据美洲钩虫序列(GenBank No.XM_013451492)设计引物,以美洲钩虫成虫cDNA为模板,通过SMART-RACE方法相继分离NaKuI3的3'和5'cDNA末端序列;构建重组表达质粒pET32a sumo/NaKuI3,将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并用Ni-NTA亲和纯化和SUMO酶酶切获得rNaKuI3,用发色底物法检测rNaKuI3对丝氨酸蛋白酶的抑制活性. 结果 成功从美洲钩虫中获得了新的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂-NaKuI3全长cDNA,推测其完整阅读框(ORF)为225 bp,编码74个氨基酸残基组成的多肽,具有19个氨基酸残基组成的信号肽.rNaKuI3对猪胰蛋白酶、人纤溶酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶和人蛋白酶3均有较强抑制作用,抑制常数(ki)分别为(16.40±2.08) nmol、(24.39±4.25) nmol、(38.39±3.92)nmol和(89.90±13.91)nmol,对人组织蛋白酶G也具有一定抑制活性,但对牛a-胰糜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶抑制作用较弱. 结论 融合蛋白美洲钩虫NaKuI3获得成功.该多肽对多种丝氨酸蛋白酶有抑制作用,是一种广谱的丝氨酸蛋白酶抑制剂,为进一步研究NaKuI3的生理学功能奠定了基础.
关键词： 美洲钩虫 Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂 原核表达 -
美洲钩虫纤溶酶抑制剂NaKuI10的表达与活性鉴定
目的 从美洲钩虫 (Necator americanus) cDNA中扩增编码NaKuI10基因片段, 构建原核表达系统, 重组表达并纯化rNaKuI10, 采用化学发色法和平板溶解试验等检测其对有关丝氨酸蛋白酶的抑制作用及纤溶活性.方法 根据GenBank MH218867序列, 从美洲钩虫cDNA中扩增出编码成熟肽NaKuI10基因片段并连接入表达载体, 构建原核表达重组质粒pET32a-sumo/NaKuI10, 鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 中, 用IPTG诱导表达, 超声破碎细菌后用镍亲和层析纯化表达产物, 在纯化柱上用SUMO蛋白酶切割融合标签获得rNaKuI10, 用发色底物法检测rNaKuI10对各丝氨酸蛋白酶的抑制活性, 通过纤维蛋白平板法和纤维蛋白原降解试验观察rNaKuI10对纤溶酶纤溶活性的抑制作用.结果 成功构建了重组质粒pET32a-sumo/NaKuI10, 表达产物纯化后获得可溶性rNaKuI10.2倍及等摩尔比的rNaKuI10分别能抑制100％及90.4％的人纤溶酶活性, 22.4％及10.3％的人胰蛋白酶活性.但1、2、5倍摩尔比的rNaKuI10对人中性粒细胞弹性蛋白酶, 组织蛋白酶G, 蛋白酶3, 胰糜蛋白酶, 胰弹性蛋白酶, 凝血酶, 凝血因子Xa (FXa) 、FXIa、FXIIa、FIXa, 活化蛋白C, 血浆激肽释放酶及FVIIa/TF均无明显抑制作用.rNaKuI10对人纤溶酶的抑制常数 (ki) 为 (0.83±0.10) nmol/L.2 000nmol/L的rNaKuI10接近完全抑制1 000nmol/L的人纤溶酶对纤维蛋白平板中纤维蛋白的溶解作用, 等摩尔比的rNaKuI10可完全抑制人纤溶酶对纤维蛋白原的降解作用.结论 NaKuI10是一种抑制活性强且特异性较好的纤溶酶抑制剂, 其生物学功能还需进一步研究.
关键词： 美洲钩虫 Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂 原核表达 纤溶酶
