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eEF1A1回复表达对敲除eEF1A1基因的Jurkat细胞增殖、凋亡的影响及机制研究
本文探讨真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)回复表达对eEF1A1基因敲除人急性T淋巴细胞白血病(TALL) Jurkat细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制.构建表达的eEF1A1慢病毒并感染eEF1A1基因敲除的Jurkat细胞,应用RT-PCR和Western blot分别检测细胞eEF1A1 mRNA和蛋白的表达；应用MTT法、Annexin V-APC标记法、DNA倍体法分别检测细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期,Western blot法检测细胞PI3 K/Akt信号通路相关信号分子的表达.结果表明,构建的eEF1A1表达慢病毒使基因敲除Jurkat细胞的eEF1A1表达明显回复.与阴性对照组相比,eEF1A1表达组Jurkat细胞增殖能力明显增强,凋亡明显减少,G0/G1期细胞比例明显减少；随着S期、G2/M期细胞比例增多,pAk、NF-kB、p-NF-kB、mTOR、p-mTOR蛋白的表达明显升高.结论:eEF1A1在T-ALL细胞中可能具有潜在的致癌作用,它的表达可有效促进Jurkat细胞的增殖并抑制凋亡,其机制可能与上调PI3K/Akt/NF-kB和PI3K/Akt/mTOR信号通路有关.
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真核翻译延伸因子1A1通过调控cyclin D2表达促进肝癌细胞增殖
目的:研究真核翻译延伸因子1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1A1,eEF1A1)表达对原发性肝癌细胞周期和增殖的影响,并探讨其分子机制.方法:免疫组织化学法检测101例肝癌及癌旁组织中eEF1A1的表达水平,并进一步分析肝癌组织中eEF1A1表达与肝癌患者临床病理参数的相关性.采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测肝癌细胞Huh7、SMMC7721、MHCC97H、Hep3B和正常肝细胞HL-7702中eEF1A1mRNA和蛋白的表达水平.在肝癌Huh7和SMMC7721细胞中分别转染特异性针对eEF1A1基因的shRNA-1/2(即eEF1A1-shRNA-1/2)和过表达质粒pcDNA3.1-eEF1A1,并采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证eEF1A1表达的变化,然后采用EdU法和FCM法分别检测肝癌细胞增殖和细胞周期的变化.另外,蛋白质印迹法检测转染eEF1A1 shRNA-1/2的肝癌Huh7细胞和转染pcDNA3.1-eEF1A1的SMMC7721细胞中cyclin D2以及信号转导与转录激活子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)通路蛋白的表达变化.结果:肝癌组织中eEF1A1表达水平明显高于癌旁组织(P＜0.001),肝癌细胞中eEF1A1表达水平明显高于正常肝细胞(P＜0.001),并且eEF1A1高表达与肝癌大小及TNM分期密切相关(P＜0.01,P＜0.05).eEF1A1-shRNA-1/2转染后,肝癌Huh7细胞中eEF1A1 mRNA及蛋白的表达水平明显降低(P值均＜0.01),G1期细胞所占比例明显升高(P＜0.01),肝癌细胞的增殖活性明显降低(P＜0.01);pcDNA3.1-eEF1A1转染后肝癌SMMC7721细胞中eEF1A1 mRNA及蛋白的表达水平明显升高(P值均＜0.01),G1期细胞所占比例明显降低(P＜0.05),肝癌细胞的增殖活性明显增高(P＜0.05).随着eEF1A1基因表达下调,Huh7细胞中cyclin D2、STAT1总蛋白和核蛋白水平均明显下降(P值均＜0.05);而过表达eEF1A1后,SMMC7721细胞中cyclin D2、STAT1总蛋白和核蛋白水平均明显升高(P值均＜ 0.05);过表达eEF1A1基因的同时加入STAT1抑制剂作用后,cyclin D2、STAT1总蛋白和核蛋白水平均无明显变化(P值均＞0.05).结论:eEF1A1通过STAT1通路调控cyclin D2表达,从而促进肝癌细胞周期进展和细胞增殖.
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白藜芦醇对裸鼠H22移植瘤的抑瘤作用
目的 探讨白藜芦醇对肝癌的体内抑瘤作用及其机制.方法 裸鼠皮下注射H22肝癌细胞建立移植瘤模型,随机分为对照组[生理盐水10 ml/kg,灌胃(ig)]、白藜芦醇高剂量组(20 mg/kg,ig)、低剂量组(10 mg/kg,ig)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)组[10 mg/kg,腹腔注射(ip)],连续给药10d,游标卡尺测量裸鼠体内肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线,处死裸鼠后称量瘤重并计算抑瘤率.采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测瘤组织中真核翻译延长因子1A1(eEF1A1)、第10号染色体磷酸酶和张力蛋白同源丢失基因(PTEN)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3和Caspase-9 mRNA表达水平,采用Western blot检测eEF1A1的蛋白表达以及磷脂酰肌醇激酶(PBK)p85、蛋白激酶B(Akt)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的蛋白磷酸化水平.结果 白藜芦醇可显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长,高、低剂量组的抑瘤率分别为46.1％和25.8％.Real-time PCR结果显示,白藜芦醇组瘤组织中eEF1A1的mRNA表达水平(10 mg/kg:86.2±24.9;20 mg/kg:63.7±14.2)较对照组(100.0±25.6)显著下降(P＜0.05),PTEN(10 mg/kg:129.3±33.0;20 mg/kg:174.7±31.9)、Caspase-3(10 mg/kg:139.6±27.2;20 mg/kg:168.8±32.3)和Caspase-9(10 mg/kg:121.2±37.3;20 mg/kg:184.6±46.2)的mRNA表达较对照组(PTEN:100.0±33.1;Caspase-3:100.0±29.6;Caspase-9:100.0±22.7)显著增加(P＜0.05).Western blot结果显示白藜芦醇组瘤组织中Akt、PI3K p85和mTOR的总蛋白表达水平无明显变化,但磷酸化水平(p-Akt:10 mg/kg:89.3±19.8;20 mg/kg:72.3±18.3;p-p85:10 mg/kg:91.3±12.9;20 mg/kg:81.2±13.2;p-mTOR:20 mg/kg:64.2±13.7)均较对照组(p-Akt:100.0±27.1;p-p85:100.0±22.5;p-mTOR:100.0±27.4)显著下降(P＜0.05),eEF1A1的蛋白表达(10 mg/kg:77.6±22.0;20 mg/kg:65.2±19.6)也较对照组(100.0±29.5)明显下降(P＜0.05).结论 白藜芦醇可显著抑制H22移植瘤的生长,其机制可能涉及抑制eEF1A1表达以及H3K/Akt/mTOR信号通路,阻滞肿瘤细胞增殖并诱导凋亡有关.
关键词： 白藜芦醇 肝癌H22细胞 真核翻译延伸因子1A1 移植瘤 信号通路
