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重组腺病毒载体Ad5-hTRX-EGFP的构建及其表达
本研究旨在构建并制备人硫氧还蛋白(hTRX)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因腺病毒载体Ad-hTRX-EGFP,感染HEK293细胞,为基因治疗提供实验基础.设计含有Not Ⅰ和EcoR Ⅴ酶切位点的引物,PCR扩增hTRX,将扩增产物连接到带有EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-hTRX-EG-FP,利用Lipofectamine2000脂质体的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHG lox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包装扩增病毒,用氯化铯高速梯度离心、纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用流式细胞仪测定感染HEK293细胞的效率,Western blot方法验证细胞表达hTRX蛋白.结果显示,重组腺病毒质粒经PCR和Not Ⅰ、EcoR Ⅴ酶切鉴定,证实含有hTRX基因,测序结果和设计片段的序列一致.重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5.558 × 1010pfu/ml.病毒成功感染HEK293细胞,MOI=100时,感染效率达92.25％.经Western blot方法验证表明,感染后的HEK293细胞高表达hTRX蛋白.结论:应用细胞内同源重组方法成功构建了含hTRX基因的重组腺病毒载体,制备获得高滴度的病毒,能高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白,为后续研究奠定了基础.
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人硫氧还蛋白在兔脑缺血再灌注损伤中的作用
目的通过CT灌注及测量脑水肿程度,观察人硫氧还蛋白(RX)对局灶性兔脑缺血/再灌注损伤的保护作用.方法采用线栓法制成一侧兔脑缺血/再灌注模型(栓塞6 h,再灌注18 h),将25只雄性新西兰白兔随机分成假手术组(5只)、缺血/再灌注组(10只)和缺血/再灌注+RX组(10只),后者给予RX(0.75 mg/kg体重),其他组给予等容积的生理盐水.分别于梗死后6 h及再灌注后18 h做CT灌注图像,计算脑梗死面积占同侧同层大脑半球面积的百分比;测量脑组织含水量.结果脑缺血/再灌注后,应用RX治疗,脑梗死面积显著减少,脑水肿减轻.结论重组RX对脑缺血/再灌注损伤有显著的治疗作用.
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人的睾丸组织硫氧还蛋白cDNA的克隆及序列测定
目的克隆人硫氧还蛋白(human thioredoxin,hTRX)cDNA序列并进行序列测定.方法①应用RT-PCR技术以成人睾丸组织RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因.②应用PCR技术以人的睾丸组织cDNA文库为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因.二者分别克隆至pGEMR-T Easy 载体中进行基因序列测定.结果将所得序列与EMBL Data LibraryX54539提供的序列比较,其可译框架相同.将所得序列与GenBank(J04026)提供的序列比较,酶活性位点(Trp-Cys-Pro-Cys)与其相同,第117、222位碱基与其不同,编码的氨基酸也发生了变化.结论从睾丸组织或基因文库中克隆均获得编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,为进一步探讨hTRX的生物学活性和应用奠定基础.
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人硫氧还蛋白基因克隆及其重组逆转录病毒载体的构建和鉴定
目的 克隆人硫氧还蛋白(hTRX)基因,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体.方法 利用RT-PCR法,以PHA活化的人外周血单个核细胞总RNA为模板,扩增hRX编码蛋白的cDNA基因,并亚克隆至逆转录病毒载体pSIV-1中进行PCR、双酶切和测序鉴定.结果 将所得的序列与GenBank(BC00377)报道的序列比较,其酶活性中心(Trp-Cy8-Gly-Pro-Cys)与已知序列一致,第132、136、170、264位碱基与已知序列不同,其中第136、170位相应密码子编码的氨基酸发生了变化(Phe→Leu,Ile→Thr),成功获得了pSIV-1-hTRX重组逆转录病毒载体.结论 hTRX基因的克隆及其重组逆转录病毒载体pSIV-1-hTRX的构建,为进一步探讨hTRX的生物学活性和应用奠定了基础.
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人硫氧还蛋白cDNA的克隆和表达
我们在本研究中克隆出hTrx成熟区cDNA序列并在原核中高效表达出hTrx蛋白,现将结果报道如下.
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人硫氧还蛋白1在大肠杆菌中的重组表达及其对高糖导致的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用
目的 克隆人硫氧还蛋白1(hTRX1)基因并构建其原核表达载体,获得重组人硫氧还蛋白1(rhTRX1),评价rhTRX1对高糖导致的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用.方法 采用逆转录PCR方法扩增hTRX1基因片段,插入pET22b(+)质粒并转化大肠杆菌Rosetta-gami(2),获得工程菌Rosetta-gami(2)-pET22ab(+)/hTRX1.用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定重组蛋白的正确性,用镍亲和层析纯化重组蛋白.采用高糖制备HUVEC损伤模型,MTT比色法检测HUVEC的存活率,生化方法测定HUVEC中乳酸脱氢酶(LDH)的外漏率以及细胞上清液中一氧化氮(NO)的水平.结果 构建的工程菌及其产生的重组蛋白rhTRX1正确.与正常对照组比较,高糖损伤组HUVEC的存活率降低、LDH外漏率明显升高,NO的水平明显地降低.不同剂量rhTRX1处理组HUVEC的存活率升高、LDH的外漏率明显降低,NO的水平明显地升高.结论 成功克隆并在大肠杆菌中表达rhTRX1、获得结构正确的rhTRX1,rhTRX1对高糖诱导的HUVEC损伤具有保护作用.
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hTrx基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定
目的: 构建携带人Trx(硫氧还蛋白)基因的逆转录病毒载体.方法: 用DNA重组技术, 将人Trx基因定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN, 用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定.以磷酸钙转染法, 将重组的逆转录病毒载体转染入包装细胞系PA317, 并用G418筛选的方法测定转染细胞上清中病毒的滴度.结果: 构建了重组逆转录病毒载体, 经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切, 电泳出现两个条带, 分别为0.3 kb和5.9 kb.转染细胞上清中病毒滴度为5.5×109 cfu/L.提示构建携带人Trx基因的逆转录载体成功.结论: 携带人Trx基因的逆转录病毒载体成功构建为Trx基因的治疗、实验研究奠定了基础.
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人硫氧还蛋白cDNA的克隆及序列测定
目的克隆人硫氧还蛋白(Human Thioredoxin，hTRX)cDNA序列并进行序列测定。方法应用RT-PCR技术，以143(TK-)人骨肉瘤细胞RNA为模板，扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因，并克隆至pGEM-T Easy载体中进行基因序列测定。结果将所得序列与GenBanK(J04026)提供的序列比较，其酶活性中心(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)和基序与已知序列一致，第180、284位碱基与已知序列不同，编码的氨基酸也发生了改变。结论克隆得编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因，为进一步探讨hTRX的生物活性和应用奠定了基础。
