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逆转录病毒载体转染的人凝血因子Ⅸ基因在人脐带组织源间充质干细胞中的表达
为了研究逆转录病毒(pLEGFP-N1)转染的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在人脐带间充质干细胞中的表达,应用DNA重组技术将hFⅨ cDNA构建入pLEGFP-N1载体,转导入包装细胞系Pheonix细胞,应用病毒上清感染人脐带组织源间充质干细胞(hUCT-MSCs),经G418筛选10天后获得全部的转染阳性细胞,从蛋白质水平和其功能活性上检测hFⅨ的表达.结果显示:配养上清液中可检测到hFⅨ的表达,每24小时分泌量达2.68±0.36μg/106细胞.Western blot检测表明,转导hFⅨ的hUCT-MSCs能分泌预期分子大小的hFⅨ入上清.功能性凝集测定实验表明了转导FⅨ的hUCT-MSCs 2天培养上清中hFⅨ的活性为100%-130%.结论:pLEGFP-N1-hFⅨ能有效地转导hUCT-MSCs,并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ,这为hUCT-MSCs成为血友病B基因治疗的细胞载体研究奠定了基础.
关键词： 逆转录病毒 人凝血因子Ⅸ 人脐带组织源间充质干细胞 基因治疗 血友病B -
高纯度凝血因子Ⅸ制剂的制备方法
人凝血因子Ⅸ（F Ⅸ）为参与人体凝血过程中不可或缺的维生素 K 依赖型糖蛋白，相对分子质量大小约57 kDa，在体内由肝细胞合成并分泌到血液中。血浆中人凝血因子Ⅸ的浓度很低，健康成年人为5μg / mL 左右［1］。当血浆中人凝血因子Ⅸ含量或活性大幅下降时，内源性凝血途径受到阻碍，人体无法进行正常的凝血，从而引发 B 型血友病。B 型血友病患者必须补充外源的人凝血因子Ⅸ，才可以恢复正常的凝血时间，且目前没有其他的任何替代品。目前，主要靠输注人凝血酶原复合物（PCC）进行治疗，但输注 PCC 后可能产生静脉血栓和弥散性血管内凝血等不良后果［2］。这种不良反应是输注 PCC时其他凝血因子或多余的凝血酶原成分所造成的。目前，国外已开发出重组及人源性的凝血因子Ⅸ制剂，如 Baxter 公司生产的静脉注射用冻干重组凝血因子Ⅸ制剂 RIXUBIS，辉瑞公司的注射用重组人凝血因子Ⅸ制剂 BeneFIX?及 CSL Behring 公司生产的从人血浆中提取的静脉注射用冻干因子Ⅸ制剂MonoFIX?- VF，但国内尚无重组及人源性的因子Ⅸ制剂。PCC 易引起不良反应，开发高纯度的凝血因子Ⅸ制剂具有重要的现实意义。近几年很多厂家都在致力于人源性高纯度 F Ⅸ制剂的研究开发。现结合国内外研究资料，对高纯度 F Ⅸ制剂的制备方法作一综述。
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柱层析法制备高纯人血FIX研究初探
鉴于临床上对高纯病毒灭活制剂的要求,建立了以人新鲜血浆为原料,用DEAE-Sephadex A50,DEAE-Sepharose FF和Heparin-Sepharose CL-6B制备高纯度FⅨ的方法,FⅨ比活为35±2.0IU/mg,回收率为30±4%,纯化3500倍.此工艺在制备高纯度FⅨ方面有很好的规模化前景.
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国产冻干人凝血酶原复合物质量标准的研究
目的通过对国产人凝血酶原复合物(PCC)质量的研究,建立与国际接规的质量标准.方法用人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ(FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ)浓制剂国家标准品,采用一期法测定国内用不同原料制备的PCC中FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ的效价;用正常人血浆作标准,用凝固法检测PCC的总效价及PCC中的肝素.结果用血浆作原料提纯制备的PCC,FⅣ的效价能达到10 IU/ml以上,FⅦ效价低;用组分Ⅲ作原料,FⅣ活性损失很大,只有2/7批次能达到10 IU/ml;而FⅦ效价高.无论用何种原料,FⅡ和FⅩ活性均能保持在一定水平.结论从血浆中直接提纯制备PCC,能有效地保持FⅣ活性,各项指标易达到国外同品种的质量标准.
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两种方法检测人凝血因子Ⅸ的细菌内毒素
人凝血因子Ⅸ(human coagulation factor Ⅸ,F Ⅸ)临床应用于控制与预防B型血友病(先天性九因子缺乏症,又称圣诞节症)的出血[1],包括接受外科手术时的出血控制与预防出血等.人凝血因子Ⅸ作为一种在研的静脉注射制剂,药典未收载其质量标准,热原含量检测为制品研发质量控制中必要的一项生物学安全指标[2-4].热原检查方法有家兔法和细菌内毒素法,其中家兔法为活体动物实验,能直观反应所有类型热原物质对机体的致热情况,操作繁琐,无法定量,制品生产过程的热原控制较困难;细菌内毒素法仅能测定供试品中细菌内毒素的含量,可定量,快速测定[5].本文参照国外药典及中国药典2015年版三部中热原检查法、细菌内毒素检查法中的动态浊度法,初步建立了家兔法和动态浊度法检测人凝血因子Ⅸ中热原的检测方法[6-12].
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人凝血酶原复合物冻干保护剂及冻干工艺的研究
目的 对人凝血酶原复合物冻干保护剂及冻干工艺进行研究,生产出符合中国药典要求的产品,提高人凝血因子Ⅸ回收率.方法 通过对冻干保护剂甘氨酸不同添加浓度的研究比较,得到佳的甘氨酸添加浓度;探讨不同冻干工艺对人凝血酶原复合物的影响,优化得到佳冻干工艺.结果 冻干保护剂甘氨酸的佳添加浓度为20 g·L-1;佳冻干工艺为:制品快速降温到-45.0℃保持3h冻结,退火到-15℃,再冻结,保持3h后,抽真空,真空度保持在10 Pa左右后,开始加热,升温至0℃升华;升华完毕,梯度升温(每小时升高10～20℃);制品温度升至30℃后,制品进入干燥后阶段,保持数个小时,温度不超过35℃.结论 通过对人凝血酶原复合物处方及冻干工艺进行优化,制备出了符合中国药典要求的冻干产品,人凝血因子Ⅸ收率提高了约18％.
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高效的红细胞特异性表达系统的建立和优化
目的 探讨慢病毒载体中红细胞特异性基因调控元件的优化对小鼠红白血病(murine erythroleukemia,MEL)细胞向红系终端分化期间组织特异性表达重组蛋白的影响.方法 改变红细胞特异性β-珠蛋白启动子编码长度、改变β-珠蛋白基因位点控制区DNase Ⅰ高敏位点(hypersensitive site,HS)的组合、删除β-珠蛋白3′端增强子或β-珠蛋白内含子IVS2,由此构建一系列由不同缺失组合的基因调控元件控制目的 基因(如人凝血因子Ⅸ)表达的慢病毒载体,包装成重组慢病毒,测定病毒滴度,并分别感染小鼠MEL细胞.用O6-苄基鸟嘌呤(O6-benzylguanine,BG)-卡莫司汀[1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea,BCNU]联合筛选以富集感染的阳性细胞,用酶联免疫吸附测定方法检测目的 基因的表达,评估不同基因调控元件组合对重组慢病毒载体所携带的目的 基因表达的影响.结果 经限制性内切酶谱分析和序列测定,构建的慢病毒载体结构正确;三质粒系统瞬时转染人肾胚胎293T细胞包装的重组自灭活慢病毒可通过长时间高速离心有效浓缩;用50 μmol/L BG-50 μmol/L BCNU联合筛选可有效富集感染的阳性细胞;经环六亚甲基双乙酰胺(N,N′-hexamethylenebisacetamide,HMBA)诱导第8天的106个小鼠MEL细胞中表达的重组人凝血因子Ⅸ平均质量浓度达到正常水平的3.8%(191 ng/ml).结论 通过适当减少调控元件优化慢病毒载体不仅有助于提高携带的外源基因片段长度、增加载体制备的有效性、实现温和提高目的 基因产物达到治疗水平需求量的目的,而且为开展以红细胞特异性表达载体介导的携带蛋白类药物的红细胞治疗以及非血液病基因治疗奠定临床前的研究基础.
