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以HIV-1 IN-LEDGF/p75相互作用为靶点的抑制剂筛选
目的 晶状体上皮源性生长因子 p75 蛋白(LEDGF/p75)与 HIV-1 整合酶(IN)之间的蛋白-蛋白相互作用是开发抗 HIV-1 药物的有效靶点,本文旨在寻找以 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用为靶点的小分子抑制剂.方法 采用均相时间分辨荧光技术(HTRF)筛选了 799 个化合物,比对 IN-LEDGF/p75 相互作用的抑制活性.结果 发现 5 个化合物——肾上腺酮、6-溴-1,2-二氢萘-1,2-二酮、头孢噻吩、根皮含柘树呫吨酮 L 和迷迭香酸对该相互作用表现出不同程度的抑制作用,其 IC50值分别为12.3、22.7、26.2、18.5 和 1.13 μmol/L.结论 为 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用抑制剂的发现以及新的抗 HIV-1 药物的开发提供了重要基础.
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LEDGF/p75蛋白的可溶性表达、纯化及功能研究
HIV-1整合酶(integrase,IN)是病毒复制过程中的一个关键酶,其与宿主晶状体上皮源性生长因子p75(lens epithelium-derived growth factor p75,LEDGF/p75)的蛋白-蛋白相互作用是筛选抗病毒药物的一个重要靶点.为开展以IN-LEDGF/p75相互作用为靶点的抑制剂研究,本研究构建了LEDGF/p75蛋白重组质粒,在原核细胞中进行了可溶性表达和功能研究.根据大肠杆菌密码子偏爱性,全合成高利用率密码子的LEDGF/p75基因序列,并克隆到表达载体pGEX-4T-1中构建重组质粒.在大肠杆菌中优化表达LEDGF/p75蛋白,经SDS-PAGE鉴定和亲和色谱纯化蛋白,采用酶联免疫吸附实验方法(ELISA)测定了LEDGF/p75蛋白的生物学活性.结果显示,构建的重组质粒获得高效稳定的可溶性表达,ELISA证实体外表达的LEDGF/p75蛋白能够与HIV-1 IN相互作用,并促进IN链转移反应的完成.本研究为建立以LEDGF/p75-IN相互作用为靶点的抗HIV药物筛选平台打下了基础.
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晶状体上皮源性生长因子对MGARP基因的调控作用研究
目的:研究HEK-293T细胞中晶状体上皮源性生长因子(lens epithelium-derived growth factor,LEDGF)对富含酸性氨基酸的线粒体定位蛋白(Mitochondria-localized Glutamic Acid Rich Protein,MGARP)基因表达的调控作用.方法:将不同剂量的含有LEDGF基因的载体,转入HEK-293T细胞中,通过Western blot和启动子报告分析检测的方法,检测细胞内MGARP的表达水平.并采用LEDGF和Sp1共同转染的方法,来检测二者对MGARP转录活性的协同调控作用.结果:与空载体对照组相比,随着含有LEDGF基因载体剂量的增加,HEK-293T细胞内MGARP的表达也明显上调(P＜0.05),同时共同转染LEDGF和Sp1后,细胞内MGARP的转录活性比单独过量表达LEDGF或者Sp1的转录活性明显增高(P＜0.05).结论:在HEK-293T细胞中,LEDGF可以调控MGARP的表达,而且,LEDGF和Sp1对MGARP的调控具有协同作用.
