首页 > 文献资料
-
双靶向配体化力达霉素DTLL的制备优化和稳定性研究
目的 通过对具有高效抗肿瘤活性的类抗体偶联药物——双靶向配体化力达霉素(DTLL)制备过程的优化,获得纯度高和活性强的DTLL产品;探讨影响DTLL稳定性的主要因素,为临床申报和工业化生产提供依据.方法 分别对DTLL前体(DTLP)蛋白表达载体、宿主菌株、表达温度、诱导剂终浓度、菌体密度和诱导时间进行优化.以高压破碎法提取可溶性目的蛋白,采用Ni+亲和与分子筛层析两步纯化,得到高纯度DTLP,再与力达霉素发色团组装获得DTLL.采用HPLC、MTS、ELISA法进行稳定性试验,分别监测DTLL冻干样品的蛋白纯度、发色团含量、细胞毒和亲和力活性的变化.结果 经过发酵提取工艺优化,每升发酵液所得DTLP蛋白约为22 mg,是优化前每升9 mg的2.4倍,其蛋白纯度达到99.7％;DTLL组装效率达到68％;稳定性试验结果显示,DTLL冻干样品对光照敏感,在-80℃低温避光环境下可稳定保存.结论 成功优化了双靶向配体化力达霉素DTLL的制备工艺,提升了产品纯度和产率,为其后续生产和临床申报提供了实验基础,也为其他抗体偶联药物的制备提供了较成熟完善的技术平台.
-
包封和释放过程中稳定蛋白质结构的研究进展
药用蛋白质从生物可降解聚合物中释放的过程始终影响蛋白质的三维结构、化学性质和完整性.在使用常用的水/油/水(W/O/W)双重乳化技术包封蛋白质时,要想保持其稳定性就需要提高蛋白质的热力学稳定性或者通过使用各种添加剂使蛋白质避免接触失稳剂(如W/O界面).然而,当人们使用W/O/W技术时,蛋白质的稳定性仍存在问题.因此,探索其他解决这种问题的方法就受到了关注.这些替代方法,如固/油/油(S/0/O)和固/油/水(S/O/W)技术是基于将干燥的蛋白质粉末悬浮于无水有机溶剂中的一种技术.很明显,蛋白质结构在有机相中的稳定性是由于蛋白质在此状态下是"僵硬的",因而蛋白质结构的干扰是禁阻的.本文主要介绍在应用各种不同的包封技术时如何保持蛋白质结构和性能的稳定性.
-
聚乳酸-羟基乙酸微球内葡激酶突变体(K35R)的稳定性研究
目的 研究微球内葡激酶突变体(K35R,DGR)的存在状态和影响其稳定性的主要因素.方法 使用傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)研究了微球内DGR的二级结构的变化,并纤溶活性测定法考察了pH和聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)表面对DGR稳定性的影响.结果 ①包封的DGR的二级结构明显发生了改变,但是,这种改变是β-折叠受到微扰的结果,并未影响微球内DGR的稳定性;②体外释放时,微球内PLGA的降解产物产生的酸性微环境会导致DGR变性,在内水相中加入Mg(OH)2纳米粒可以抑制DGR的变性聚集;③对PLGA吸附DGR的研究表明,PLGA表面对DGR的吸附是离子相互作用和疏水相互作用共同起作用的结果,也是造成DGR失活的重要原因.结论 PLGA对DGR的包封会导致蛋白质药物的二级结构发生变化,但是并不影响微球内DGR的稳定性;导致微球内DGR变性失活的主要原因是微球内的酸性微环境,碱性添加物可以抑制这种变性失活.PLGA表面对蛋白质药物的非特异性吸附也会导致部分DGR的失活.
关键词： 葡激酶突变体 聚乳酸-羟基乙酸微球 蛋白质稳定性 傅立叶变换红外光谱 -
乳酸-羟乙酸共聚物微球中rhCu,Zn-SOD稳定性研究
目的以rhCu,Zn-SOD为模型蛋白,包裹入可生物降解聚合物PLGA内制备微球缓释制剂,详细研究制备过程中各因素以及体外释放对Cu,Zn-SOD活力和结构完整性的影响.方法连苯三酚自氧化法测定酶活性,凝胶电泳考察蛋白质结构完整性的变化.结果单独的超声或和二氯甲烷有机溶剂长期接触对Cu,Zn-SOD的活性影响不大,不破坏蛋白质的结构;体外释放时聚合物降解引起的微酸环境使rhCu,Zn-SOD二聚体解离形成亚基,微球中添加的赋形剂影响聚合物的水解速度.微球的体外释放呈现两个阶段,首次突释后,介质中蛋白质含量有所下降,约1周后释放量才快速递增,属于不完全释放.结论制备过程中对rhCu,Zn-SOD活力和结构完整性的影响不大,可在较大范围内改变工艺条件制备高载药量且稳定性好的rhCu,Zn-SOD微球.
-
织构复合水化体系的假说第四报:水复合方式初探
背景:人体组织中的水分子和生物大分子结合形成水复合物.不同类型的大分子与水分子复合的方式也不同.目的:讨论水分子和生物大分子进行复合的基本方式.方法:提出了织构复合水化体系(TCHS)的理论假说.通过计算机检索相关文献,对这些问题展开讨论.结果与结论:根据水在水复合体中的作用特点,可以分类为如下4种复合方式.①表面复合:球状蛋白质分子或DNA分子表面形成水复合膜层.水膜层显示水分子运动速度和水化密度由表及里逐渐减弱.水复合膜确保大分子的几何形态和物理状态稳定,而且在TCHS形成中发挥重要作用.②溶胀复合:由于糖胺聚糖的强烈水合作用,水复合的蛋白聚糖发生溶胀,显示高黏度和水凝胶特性.它在结缔组织中发挥重要的力学贡献,如赋予软骨以强大的抗变形能力.③疏水复合:在疏水作用下磷脂分子经结构重排形成脂双分子层结构(生物膜).该亲水-疏水-亲水的"三明治"结构,有助于自身的力学稳定、与膜蛋白的结合、跨膜运输等.④缝隙复合:细胞内外大量存在着纳米尺度的狭窄空间,位于其中的水溶液因水分子发生重排而物性异常,如黏度增高、冰点下降等.缝隙复合和表面复合两者具有某些共性,前者可以看作是后者的一种特例.上述的分类方法不具有绝对的涵义.但是合理运用这些水复合方式将有助于研究织构复合水化体系的理论.
-
地龙提取液中蛋白质的稳定性研究
目的:对影响地龙提取液中蛋白质稳定性的因素进行研究.方法:通过考马斯亮蓝法建立了地龙提取液中蛋白质的含量测定方法,并考察了温度、pH值、无机盐及有机溶剂等因素对提取液中蛋白质稳定性的影响.结果:在30℃、pH值为7的条件下,提取液中蛋白质的含量高,而加入无机盐或有机溶剂后蛋白质含量均有所降低.结论:提取液的佳保存条件为30℃、pH值7,且提取过程中应尽量减少无机盐和有机溶剂的使用.
-
人纤维结合蛋白制备方法的建立及人纤维结合蛋白稳定性初探
目的 建立人纤维结合蛋白(fibronectin,Fn)制备方法,研究不同保护剂对Fn稳定性的影响.方法 将经磷酸盐缓冲液抽提溶解的血浆冷沉淀用聚乙二醇沉淀,获得的上清液经离子交换层析制得纯化的Fn.将加入复合保护剂的Fn溶液分别于-20、4和37℃存放0、5和14 d,观察保护剂抑制Fn降解的效果.结果 采用建立的方法制备的Fn的纯度和平均回收率均＞80％.Fn稳定性研究显示,Fn于4℃存放会发生降解,加入枸橼酸钠+甘氨酸或枸橼酸钠+咪唑复合保护剂能有效抑制Fn降解.结论 采用建立的方法制备Fn是可行的.枸橼酸钠+甘氨酸或枸橼酸钠+咪唑复合保护剂对Fn具有保护作用.
-
重组人心肌TnI-TnC复合物的特性及其初步应用
目的:从含有人cTnI-TnC基因的表达菌中抽取目的蛋白,并对其进行纯化、鉴定及稳定性的初步研究.方法:取表达菌株BL21(DE3)-pET28a-cTnI-TnC,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,NTA树脂亲和层析纯化后,检测其免疫反应性和稳定性,并试验了在4种不同液体基质中cTnI-TnC复合物的稳定性.结果:cTnI-TnC表达水平高,可溶性好.免疫分析显示较高的特异免疫反应性和稳定性.筛选到了能使cTnI-TnC复合物在液态下保持稳定的基质.结论:cTnI-TnC复合物能通过基因工程手段大量获取,并具有较高的免疫反应性和稳定性.含EDTA的10% BSA磷酸缓冲液或含10%小牛血清的磷酸缓冲液是其合适的基质.初步认为cTnI-TnC复合物可以作为cTnI免疫测定用的参考标准品或质控品.
关键词： 人心肌cTnI-TnC复合物 免疫活性 蛋白质稳定性 -
氨基酸突变对蛋白质稳定性的影响预测及其在线工具
确定氨基酸突变对蛋白质稳定性的影响对于分子水平的疾病机理理解和新蛋白质设计是十分重要的.这项研究也有助于药物学上的为提高蛋白质药物的稳定性而对其进行的改造与重组以及免疫学上的疫苗设计.实验测定费时费力且代价昂贵.计算方法已用来预测突变的影响和阐明其潜在的生物学机制.本文阐述预测残基突变对蛋白质稳定性影响的两类方法:使用能量函数直接计算法和机器学习方法；介绍15个新在线预测工具并说明面临的挑战与未来的方向.
