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采用绿色荧光蛋白腺病毒载体表达HBsAgCTL优势表位肽MHC单链三聚体
目的 采用携带GFP报告基因腺病毒载体表达HBsAg细胞毒性T细胞(CIL)表位MHC单链三聚体,为增强HBV特异性免疫提供新方法.方法 构建小鼠MHC Ⅰ类分子(H-2Ld)限制的HBsAg优势CTL表位肽与MHCⅠ类分子重链(Ld)和β2M链(β2-microglobulin,β2微球蛋白)的单链三聚体(HBsAg-SCT).并将HBsAg-SCT亚克隆到GFP标记腺病毒载体,以HBsAg和OVA-SCT作为对照,转染293A细胞,包装产生携带HBsAs-SCT,HBsAg和OVA-SCT的重组腺病毒.结果 经双酶切和克隆测序鉴定,HBsAg-SCT能成功克隆到编码GFP标记的腺病毒载体,通过荧光显微镜观察到转染的293A细胞含有绿色荧光素蛋白.通过Western Blot进一步证实表达的重组蛋白HBsAg-SCT能与抗-腿抗体发生反应.结论 编码HBsAg-SCT的荧光蛋白腺病毒载体成功构建,并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒.
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葡萄膜炎自身抗原表位的研究
多种抗原参与自身免疫性葡萄膜炎的发生发展,但是这些抗原的免疫优势表位尚不明确.针对视网膜S抗原等葡萄膜炎自身抗原免疫表位的研究显示,每种抗原蛋白均存在多个可诱导易感动物葡萄膜炎发作的致病位点,每种抗原均存在多个可诱导葡萄膜炎患者产生体外细胞免疫反应的免疫原性表位,同种抗原的致病表位和免疫原性表位不完全一致.葡萄膜炎患者对于各抗原表位肽的反应性显示出高度异质性,表现为不同患者对不同肽发生反应和同一例患者在不同时期对不同肽发生反应.由此,提出了葡萄膜炎表位扩展现象,并利用动物实验得以证实.表位扩展可能是自身免疫反应的防御现象,但是自身免疫反应的多样化同时又对抗原特异性耐受疗法提出了挑战.
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抗synuclein-γ单克隆抗体识别的抗原表位区域的确定
目的:确定已获得的多株抗突触蛋白γ(synulcein-γ,SNCG)单克隆抗体识别的抗原表位区域,为相关后续研究奠定基础.方法:分别构建谷胱甘肽疏基转移酶(GST)与SNCG不同截短体的表达载体并表达GST-SNCG截短体融合蛋白,采用EUSA和Western blot检测单抗与不同截短体融合蛋白的反应,推知不同单抗的抗原识别表位区域.依据推测的抗原识别表位的区域,构建并表达GST-表位小肽融合蛋白,并用相应单抗进行ELISA和Western blot检测,确定单抗的抗原表位区域.结果:确定了11株SNCG单抗的抗原识别表位区域,分别是9#、42#和3E4抗体的抗原表位位于SNCG第1到21位氨基酸,11#和22#抗体的抗原表位位于SNCG第78～92位氨基酸,1#、14#、18#、31#和36#抗体的抗原表位位于SNCG第93到110位氨基酸,6C8抗体的抗原表位位于SNCG第111～127位氨基酸.结论:确定了11株SNCG单抗的抗原识别表位区域,为SNCG的进一步研究和血清学检测奠定了基础.
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NMDA受体2B亚基模拟表位对慢性神经病理性痛大鼠的镇痛效应
目的 评价N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)模拟表位对慢性神经病理性痛大鼠的镇痛效应.方法 成年雄性SD大鼠25只,体重200-250 g,随机分为5组(n=5),C组不进行任何处理;神经损伤(SNI)组行左后肢保留性SNI术;NR2B单纯免疫组(pNR2B组)于皮下两点注射携带NR2B模拟表位的特异性噬菌体(pNR2B)4×1012 pfμ/ml,每点100 μl,间隔1周后重复注射,共重复2次;无关噬菌体+SNI组(pSNI组)和pNR2B+SNI组(pNR2B/SNI组)于相应时点分别注射无关噬菌体或携带NR2B模拟表位的pNB2B,于首次注射后1周时行左后肢SNI术.持续观察大鼠痛行为学,分别于SNI术前1 d、术后1 d、1、2和3周测定左后爪机械刺激缩足反应阈值(MWT).首次注射后4周,采用间接ELISA法测定血清NR2B抗体和噬菌体抗体水平.结果 与C组和pNR2B组比较,SNI组和pSNI组术后1 d出现痛行为学症状,MWT降低,并持续至术后3周;pNR2B/SNI组术后1 d、1、2周痛行为学症状无明显缓解,术后3周痛行为学症状明显缓解,MWT差异无统计学意义(P＞0.05).与SNI组和pSNI组比较,pNR2B/SNI组术后1周痛行为学症状明显缓解,MWT升高,持续至术后3周.pNR2B组、pSNI组和pNR2B/SNI组血清噬菌体抗体水平高于C组和SNI组(P＜0.05),pNR2B组和pNR2B/SNI组血清NR2B抗体水平明显高于其他3组(P＜0.05).结论 NR2B模拟表位通过诱导SNI致慢性神经病理性痛大鼠产生NR2B抗体,产生明显的镇痛效应.
关键词： 受体 N-甲基-D-天冬氨酸 免疫显性表位 神经痛 -
类风湿关节炎共同表位QK/RRAA对蛋白激酶A通路的抑制作用
目的研究类风湿关节炎(RA)共同表位QK/RRAA及其变异对细胞内蛋白激酶A(PKA)信号通路的影响。方法测定HLA-DRβ10404及其变异体转基因细胞内PKA、cAMP及腺苷环化酶(AC)的浓度及活性。结果 HLA-DRβ10404转基因细胞的PKA活力、cAMP水平及AC活力明显低于HLA-DRβ10403转基因细胞株(P＜0.01)。HLA-DRβ10404序列第70～74位氨基酸QRRAA中的Q70及A74是抑制PKA信号通路的关键氨基酸。结论类风湿关节炎共同表位QK/RRAA的表达可抑制PKA、cAMP和AC的活性，并由此参与类风湿关节炎的发病。
关键词： 关节炎 类风湿 HLA-DR1抗原 cAMP依赖性蛋白激酶 免疫显性表位 -
恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体制备及功能分析
目的 制备恶性疟原虫(FCC1/HN株)融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体,分析其生物学特性及功能.方法 用PfCP-2.9免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行融合,制备单克隆抗体,并分析其特性.结果 获得1株能分泌抗PfCP-2.9的小鼠杂交瘤细胞株单克隆抗体F12D,经免疫球蛋白类型和亚类鉴定为IgG1.ELISA和蛋白质印迹法(Western blotting)显示单克隆抗体F12D能与PfCP-2.9发生特异性反应,F12D所识别的PfCP-2.9抗原表位不能耐受还原剂巯基乙醇,表明F12D识别的是构象表位.间接免疫荧光试验(IFA)显示F12D可识别培养的FCC1/HN.体外抑制试验结果显示,F12D终浓度为0.3 mg/ml时,对FCC1/HN的抑制率为56%.结论 单克隆抗体F12D能与PfCP-2.9发生特异性反应,其所识别表位为构象表位,F12D可识别体外培养的FCC1/HN,并对其生长具有抑制作用.
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人类白细胞抗原-B特异性抗原表位Bw4对丙型肝炎病毒感染的影响
目的 探讨人类白细胞抗原(HLA)-B分子特异性抗原表位Bw4对HCV感染病情进展的影响.方法 有偿献血途径感染HCV的患者86例纳入研究,ELISA法检测患者血清HCVIgG和HCV IgM,实时RT PCR检测患者血HCV RNA,序列特异性PCR扩增技术(SSP-PCR)进行HLA分型.计数资料比较采用行×列x2检验,两组计量资料比较采用独立样本t检验.结果 86例HCV感染者中,BW4/4纯合子29例,占33.7％；BW4/6杂合子38例,占44.2％;BW6/6纯合子19例,占22.1％.Bw4/4纯合子、Bw4/6杂合子、BW6/6纯合子患者HCV RNA水平分别为(3.98±0.32)、(5.22±0.29)和(5.04±0.38) lg IU/mL,Bw4/4纯合子患者HCV RNA明显低于Bw4/6杂合子、Bw6/6纯合子组(t=2.821,P=0.0063;t=2.106,P=0.0407).Bw4/4纯合子、Bw4/6杂合子、BW6/6纯合子HCV感染者中,自然清除率分别为58.6％、26.3％及21.0％,Bw4/4纯合子者HCV自发清除率明显高于Bw4/6杂合子、BW6/6纯合子患者(x2=7.135,P=0.008;x2 =6.583,P=0.010).携带Bw4/4纯合子抗原表位的HCV感染者发生病毒自发清除的可能性是Bw4/6杂合子及BW6/6纯合子的4.351倍(OR=4.351,95％CI:1.676～11.294).结论 携带Bw4/4纯合子的HCV感染者,病毒载量较低、病毒自发清除率较高,Bw4抗原表位对HCV感染具有一定的保护性.
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沙眼衣原体感染血清学筛查候选蛋白组合的优化
目的 优化适用于沙眼衣原体感染血清学筛查的候选抗原蛋白组合.方法 收集天津医科大学总医院性病门诊经胶体金法检测沙眼衣原体感染者的血清和泌尿生殖道分泌物拭子各50份,胶体金法检测沙眼衣原体未感染者的血清和泌尿生殖道分泌物拭子各30份,此30份血清微量免疫荧光(MIF)法检测为阴性.以沙眼衣原体蛋白Hsp60和MOMP为参照,选择沙眼衣原体Pgp3、CPAF、CT143、CT101、CT694、CT875、CT813、IncA共8种免疫优势蛋白为抗原,检测血清中的相应抗体,将该结果与血清MIF检测和泌尿生殖道分泌物沙眼衣原体细胞培养两种传统金标准作比较,确定具有高敏感性和特异性的抗原蛋白组合.结果 50份胶体金法阳性标本中,MIF检测阳性44份,阴性6份;细胞培养阳性14份,阴性36份.沙眼衣原体Pgp3、CT694和CT875这3种免疫优势蛋白组合的血清学实验结果与MIF阳性符合率达到97.73％(43/44).30份胶体金法检测沙眼衣原体阴性标本中,30份血清标本经MIF检测全为阴性,也未检出上述3种蛋白抗体.结论 Pgp3、CT694与CT875免疫优势蛋白组合用于沙眼衣原体感染的血清学初筛具有很好的敏感性和特异性,且操作简单,易于推广.
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三种表达肽检测进展期白癜风患者血清酪氨酸酶抗体的比较
目的 应用三种表达肽TYR240-300,TYR240-479和TYR检测进展期白癜风患者血清酪氨酸酶IgG抗体,比较三者的抗体检测差异,筛选优势抗原.方法 原核表达、纯化三种表达肽TYR240-300,TYR240-479和TYR,Western印迹鉴定纯化蛋白;以纯化的三种表达肽作为抗原,以提取的黑素细胞总蛋白作为阻断抗原,进行阻断ELISA分析;以纯化的三种表达肽作为抗原,检测100例进展期白癜风患者血清中酪氨酸酶IgG抗体,比较三种表达肽的抗体检测阳性率及滴度差异.结果 三种表达肽均能被天然的黑素细胞抗原所阻断,100例进展期白癜风患者血清中,抗TYR240-300 IgG抗体与抗TYR240-479 IgG抗体阳性率分别为32.0%和62.0%,不同型别患者两种抗体检出阳性率差异较大,泛发性(8例)分别为4例和7例,局限性(8例)分别为3例和4例,散在性(48例)分别为31.3%和60.4%,肢端性(19例)分别为20.0%和52.6%,节段型(17例)分别为47.1%和82.4%.40例进展期白癜风患者血清中抗TYR240-479 IgG抗体与抗TYR IgG抗体的阳性率相近,分别为62.5%和60.0%.表达肽TYR240-479和TYR检测的进展期白癜风患者血清中IgG抗体高滴度均为1:320,而表达肽TYR240-300检测的进展期白癜风患者血清中IgG抗体高滴度均为1:160.结论 TYR 240-479是用于白癜风患者中酪氨酸酶抗体检测的优势抗原.
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不同免疫佐剂对寻常型天疱疮抗原EC1-2表位抗体亚型的影响
目的 探讨免疫佐剂的干预对寻常型天疱疮抗原EC1-2表位抗体亚型转换的影响.方法 完全弗氏佐剂(CFA)或铝[Al(OH)3]佐剂联合重组天疱疮抗原(PVA)EC1-2融合蛋白,分别免疫C57BL/6小鼠,检测免疫后细胞因子的产生及其特异性抗体的滴度和型别,并通过间接免疫荧光(IIF)及新生鼠皮肤的体外培养,观察抗血清同抗原的亲和力及其致病作用.结果 免疫后经细胞因子检测发现,CFA组小鼠IFN-γ、Th1型细胞因子增高;Al(OH)3组则以IL-4、Th2型细胞因子增高为主.两组小鼠均有特异性的抗EC1-2 IgG型抗体产生,但其亚型不同,CFA组以IgG2a为主,而Al(OH)3组则仅表达IgG1.CFA组小鼠血清IIF示弱的荧光沉积,体外实验示轻度棘层松解;而Al(OH)3组则表现为明亮的荧光沉积,体外实验出现表皮内水疱.结论 不同免疫佐剂直接影响寻常型天疱疮抗原EC1-2表位的抗体亚型.
