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2a型丙型肝炎病毒5′非编码区的RACE扩增及二级结构的分析
目的获得真全长中国大陆2a型丙型肝炎病毒(HCV)5′非编码区 (5′UTR)cDNA,并分析其一级结构和二级结构,为进一步研究其在HCV复制、翻译中的调控机制、开发新的抗HCV药物奠定基础.方法利用逆转录套式聚合酶链反应(RT-PCR)联合限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)初步筛选出1例2a型HCV感染者,采用cDNA 末端快速扩增技术(RACE)扩增出一条约800 bp的cDNA片段,A-T克隆,用RFLP与PCR鉴定重组子,全自动序列分析仪测定插入子序列,RNAdraw预测二级结构.结果 RACE法获得真全长2a型HCV 5′端序列.5个克隆中,3个克隆含全长5′UTR序列,与HCV-1,HC-C2,HC-J6,HC-J8相比,同源性分别为93.6%～94.4%, 92.1%～93.0%, 98.8%～99.7%,96.2%～96.5%,与2a型标准株HC-J6相比,21,170,222,247,339位不同,分别为G,A,C,C,T,但这些突变不影响其二级结构.另外2个克隆为5′端缺失突变株,分别缺失54 bp和144 bp.结论 RACE技术快速、有效、实用,可有效获得病毒基因组的末端序列;依此获得中国大陆2a型HCV的5′UTR cDNA;在感染者血液中存在5′端部分缺失的HCV基因片段.
关键词： 肝炎病毒 丙型 5′非编码区 序列分析 cDNA末端快速扩增技术 -
大乳头水螅RACE cDNA文库的构建
目的:为筛选和克隆大乳头水螅发育调控相关基因的全长cDNA,构建大乳头水螅RACE cDNA文库.方法:提取大乳头水螅总RNA后从其中分离mRNA,运用SMART技术构建RACE cDNA文库.为鉴定所构建文库的质量,根据GenBank中大乳头水螅actin基因cDNA序列设计5'RACE和3'RACE的引物及用于扩增actin基因编码区全长序列的引物.结果:琼脂糖凝胶电泳结果表明,RACE cDNA文库中全长cDNA的长度集中在500-2 000bp之间.5'RACE、3'RACE PCR及扩增actin基因编码区全长序列时均以本文构建的大乳头水螅RACE cDNA文库为模板,这3个PCR反应均能扩增出产物,产物大小与目标片段预计大小相似.PCR产物分别经T/A克隆及测序后证明为大乳头水螅actin基因cDNA的相应序列.结论:RACE cDNA文库的成功构建为通过RACE方法获得大乳头水螅功能基因cDNA全长序列奠定了基础.
关键词： 大乳头水螅 cDNA末端快速扩增技术 cDNA文库 -
日本血吸虫视黄酸X受体2全长cDNA的克隆及初步分析
目的 克隆编码日本血吸虫视黄酸X受体2(SjRXR2)蛋白的全长cDNA,并对其进行初步研究.方法 利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得SjRXR2蛋白全长编码cDNA.利用生物信息学技术,对基因结构进行初步分析.利用实时荧光定量(Real-time) PCR技术对该基因在日本血吸虫不同时期虫体中的转录情况进行分析.应用在线抗体表位预测软件获得SjRXR2配体结合区抗原性较强的一个多肽序列,合成该多肽片段,并免疫小鼠制备抗血清.利用Western blot技术分析该蛋白在日本血吸虫中的表达.结果 采用RACE技术成功获得了SjRXR2蛋白全长编码cDNA,总长度为5 960bp,其完整开放阅读框为4 308 bp,编码1 435个氨基酸,预测分子量为159 kDa.生物信息学分析表明该基因编码的蛋白质序列具有核受体家族2的典型结构域特征,且与曼氏血吸虫RXR2有较高的相似性.Real-time PCR分析表明,该基因在21、42d龄日本血吸虫虫体内有较高的转录水平.Western blot分析表明,小鼠SjRXR2多肽免疫血清可特异性识别日本血吸虫虫体150 kDa蛋白.结论 成功获得了编码SjRXR2蛋白的全长cDNA,并制备了针对该蛋白的特异性多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.
关键词： 日本血吸虫 视黄酸X受体2 cDNA末端快速扩增技术 核受体 -
基于cDNA末端快速扩增的刚地弓形虫核仁G蛋白-1的克隆
目的克隆弓形虫核仁G蛋白-1(NOG1)基因的全长cDNA序列.方法根据NCBI GeneBank中登录的弓形虫NOG1基因的唯一EST序列设计引物,利用cDNA 5'-末端快速扩增法(5'-RACE)和cDNA 3'-末端快速扩增法(3'-RACE)分别对已知序列进行延伸,将扩增获得的3'-端和5'-端未知序列与位于中间位置的已知序列进行拼接,然后经Blast检验全长序列的正确性.结果 5'-RACE扩增获得3个不同长度的片断,长片断全长1287 bp,去除引物和夹杂的已知序列后,通过5'-RACE在5'端扩增获得未知序列为1 196 bp.3'-RACE扩增后得到一条特异性条带,位于大约1.7kb左右,测序全长为1 634 bp,去除引物和已知序列,经3'-RACE扩增获得的3'-端未知序列为1 204 bp.Blast全长为3 167 bp的3段拼接序列,发现其覆盖NOG1基因cDNA的完整ORF或者CDS序列(650 bp-2 809 bp).推导翻译出的蛋白质一级结构包含719个氨基酸(aa),在所有已发现物种的NOG1中,弓形虫NOG1基因的cDNA和相应的aa序列都是长的.该序列已登录NCBI GeneBank,核酸序列登录号AY686734,对应蛋白质的aa序列登录号为AAT94290.结论本研究首次克隆获得了弓形虫NOG1基因的全长cDNA序列,并对相应的aa序列进行了推导翻译和简单分析.
关键词： 弓形虫 核仁G蛋白-1 cDNA末端快速扩增技术 克隆 -
高凝状态大鼠主动脉表达上调新基因HCR2的克隆及生物信息学分析
目的获得高凝状态大鼠主动脉上调表达新基因HCR2的全长cDNA,并对该基因进行生物信息学分析.方法从高凝大鼠主动脉中表达显著上调的序列标签(EST,GenBank登录号为BQ901227)出发,利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end, RACE)和巢式PCR技术扩增其全长cDNA,利用NCBI的数据库对其进行生物信息学分析.结果成功地获得了HCR2的全长cDNA,在GenBank中的登录号为AY234417.用RT-PCR证实HCR2是高凝大鼠表达上调基因.生物信息学分析显示,该基因cDNA序列全长为1275 bp,定位于大鼠染色体4q11,编码由78个氨基酸组成、相对分子质量为8841.7、pI为8.59的蛋白质;无信号肽序列和跨膜序列,很可能是一种核蛋白;与已知蛋白无明显同源性.结论 HCR2 的成功克隆为进一步研究其生物学功能及其在高血凝的发生、发展中的作用奠定了坚实基础.
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人UCA1基因新剪接变异体全长cDNA序列的克隆
目的 克隆新的UCA1剪接变异体全长cDNA序列,为研究其可变剪接机制奠定基础.方法 用电子克隆技术和cDNA序列末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增细胞系BLZ-211 cDNA并进行产物测序和序列拼接.结果 新克隆的UCA1剪接变异体全长cDNA序列为2 202 bp.结论 综合采用电子克隆技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法,为该基因的后续可变剪接机制的研究奠定了基础.
关键词： UCA1 电子克隆 cDNA末端快速扩增技术
