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新生隐球菌格鲁比变种临床株与环境株微卫星基因型的小鼠毒力实验研究
目的 了解巴西新生隐球菌格鲁比变种(C. neoformans var.grubü)多位点微卫星定型(multilocus microsatllite typing,MLMT)在临床和环境中的分布特点,探讨不同微卫星型的新生隐球菌格鲁比变种临床株和环境株的毒力差异.方法 根据多位点微卫星分型技术对分离自巴西的40株(17株临床株和23株环境株)新生隐球菌格鲁比变种进行分型,筛选出临床株及环境株中分布占优势的菌株,应用小鼠毒力试验分别对其进行毒力检测,通过发病情况及病理切片比较毒力差异.结果 40株格鲁比变种共鉴定出11种微卫星型,临床株中的优势菌株为MLMT-13型,共9株,占临床株的52.9%(9/17),环境株中的优势菌株为MLMT-36型,共10株,占环境株的43.5%(10/23);小鼠毒力试验结果显示MLMT-13型感染小鼠后发病率为100%,而MLMT-36型发病率为7.5%,且病理结果也存在明显差异.结论 格鲁比变种在从环境迁徙到宿主的过程中,毒力随环境的变化发生了改变,该变化也可在其微卫星重复序列上体现出来.该实验证明新生隐球菌格鲁比变种的分布及来源与微卫星型之间存在相关性,临床株MLMT-13型和环境株MLMT-36型之间存在着显著毒力差异.
关键词： 新生隐球菌格鲁比变种 多位点微卫星分型 小鼠毒力试验 -
新生隐球菌毒力差异菌株的全基因组测序及毒力相关基因的筛选
目的：了解及分析新生隐球菌格鲁比变种(Cryptococcus neoformans var grubii)两组毒力差异明显的多位点微卫星型(multilocus microsatellite typing,MLMT)菌株的全基因组序列,筛选出引起其毒力差异的相关基因。方法选取毒力差异为明显的不同基因型菌株各1株进行全基因组重测序,运用比较基因组学方法全面分析测序结果,使用非同义 SNPs(non-synonymous SNPs,nsSNPs)、无义突变 SNPs、产生移码突变 InDels 的策略广泛筛选差异基因。对筛选出的基因在所有实验菌株中进行 DNA 测序验证,并提取总 RNA,采用快速扩增5′和3′cDNA 末端(rapid amplification of 5′ and 3′cDNA ends,RACE)技术,克隆后测序获得对应基因的完整 cDNA 全长序列信息。结果通过全基因组重测序,环境株 IFM56731和临床株 IFM56800均分别获得127倍和111倍覆盖率的有效数据。分别对 SNPs 和 InDels 数据进行统计分析,应用无义突变 SNPs 和产生移码突变的 InDel 分别筛选出3个差异基因。对筛选出的6个基因在所有实验菌株中进行扩增测序,并对其中3个基因进行 cDNA的测序分析,终确定基因 CNAG_01032的转录序列位置和结构,并验证了预测的无义突变位点存在于实际的 mRNA 中。结论本研究通过全基因重测序数据分析证明,应用无义突变 SNPs 和产生移码突变的 InDels 进行差异基因筛选的策略具有较好针对性,并筛选出6个潜在与毒力相关的基因,通过对所有实验菌株的测序和对全长 cDNA 的测序验证,终筛选出基因 CNAG_01032为可能引起菌株毒力差异的基因。
关键词： 新生隐球菌格鲁比变种 微卫星基因分型 全基因序列分析 毒力 -
新生隐球菌毒力差异基因型菌株间部分毒力相关基因分析
目的：了解新生隐球菌格鲁比变种（ Cryptococcus neoformans var． grubii）两组毒力差异明显的多位点微卫星型（ multilocus microsatellite typing ， MLMT ）菌株间的差异基因，探讨导致新生隐球菌格鲁比变种间毒力差异的相关基因及这些基因的功能。方法根据已有基因组数据，针对可能为新生隐球菌毒力相关的基因设计特异性引物，扩增并测序，通过序列对比分析每个基因在两组微卫星基因型菌株间存在的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms ，SNPs）位点，并对引起差异的蛋白质进行分析和预测。结果在成功测序的11个基因中，除2个基因序列完全相同外，其余9个基因在两组毒力差异明显的基因型菌株间分别存在1～4个规律性SNPs，其中，有2个基因中存在非同义SNPs（ non-synonymous SNPs ，nsSNPs ），这2个基因的编码产物分别为沉默信息调节因子2家族成员HST302和UV切除修复蛋白RAD23。另外，在对RAD23蛋白的系统发育分析发现，与真菌界的其他门类相比，在担子菌纲的多数RAD23蛋白与人类的同源基因亲缘关系更近。结论本研究发现了新生隐球菌两种毒力差异明显的微卫星基因型菌株间具有重要功能的两个差异基因（ Rad23和Hst302），且经预测nsSNPs对蛋白结构和功能均有一定影响，而蛋白的具体功能有待通过各项试验进一步深入研究。
关键词： 新生隐球菌格鲁比变种 微卫星基因分型 毒力 蛋白
