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梅毒螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫活性研究
目的 表达梅毒螺旋体黏附蛋白Tp0751,纯化表达产物并进行免疫活性分析,为探索Tp0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定基础.方法 通过生物信息学分析,去除Tp0751信号肽序列,构建原核表达体进行诱导表达;Ni亲和层析柱纯化重组蛋白,Western blot检测其免疫反应性,用重组蛋白免疫新西兰家兔,评价其免疫原性.结果 成功构建了pET-28a(+)-0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了相对分子质量约为26×103的融合蛋白;Western blot检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应;利用纯化的Tp0751重组蛋白免疫新西兰家兔,能诱导家兔产生特异性免疫应答,ELISA法测定免疫血清中特异性抗体滴度在1∶10 240以上.结论 重组表达的Tp0751黏附蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其在梅毒致病过程中的作用和生物学功能奠定了基础.
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苍白密螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫反应性分析
目的 表达苍白密螺旋体(梅毒螺旋体)黏附蛋白Tp0751,纯化表达产物并进行免疫反应性分析,为探索Tp0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定基础.方法 通过生物信息学分析,去除Tp0751信号肽序列,构建原核表达体进行诱导表达;Ni亲合层析柱纯化重组蛋白,Western-印迹检测其免疫反应性.结果 成功构建了PET-28a(+)-0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了相对分子量约为26×103的融合蛋白,其表达产物占全菌总蛋白的＞30%,并且主要可溶性形式存在;Western-印迹检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性.结论 重组表达的Tp0751黏附蛋白为可溶性蛋白,且具有良好的免疫反应性,为进一步研究其在Tp0751黏附蛋白在梅毒致病过程中的作用和其生物学功能奠定了基础.
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梅毒螺旋体黏附素Tp0751重组核酸菌影制备及研究
本研究构建了Tp0751的真核重组质粒,并以BG作为佐剂和DNA递送系统,制备Tp0751的核酸菌影,以DNA初免-蛋白加免的免疫方式,观察其诱导小鼠系统和黏膜体液免疫和细胞免疫应答的能力,为发展梅毒新型疫苗奠定基础.
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梅毒螺旋体黏附素Tp0751核酸菌影的构建及免疫原性研究
目的:构建梅毒螺旋体(Tp)黏附素Tp0751的重组真核大肠埃希菌菌影(EBG)并检测其在免疫鼠中的免疫原性,为探讨新型梅毒疫苗奠定基础.方法:构建pcDNA3.1(+)/Tp0751真核表达载体,将其装载入已构建的空EBG中,形成重组核酸菌影pcD/Tp0751-BG,计算装载率;将核酸菌影转染鼠源性巨噬细胞RAW264.7,Western blot(WB)鉴定目的蛋白表达.将雌性BALB/c鼠随机分为A(PBS)、B(空EBG)、C(空pcDNA3.1)三个对照组和D(pcD/Tp0751)、E(pcD/Tp0751-BG)、F(pcD/Tp0751-BG+rTp0751)三个实验组,各组间隔两周肌注免疫共三次,检测特异性血清IgG及生殖道黏膜SIgA、小鼠脾细胞增殖水平和分泌IFN-γ水平.结果:重组真核质粒对菌影的装载率为76.1%;WB显示此转染细胞能有效表达重组目的蛋白.D、E、F实验组小鼠特异性血清IgG与生殖道SIgA效价均随免疫次数增加而增加,各时间点均显著高于三个对照组(P<0.01),于末次加免后第8周达到峰值,此时F组IgG与SIgA效价分别为1:102400与1:12800;首次加免2周后,E、F组均显著高于D组(P<0.01);末次加免2周后,F组显著高于E组(P<0.01).末次加免后第8周,D、E、F组的刺激指数(SI)值与IFN-γ水平均分别显著高于三个对照组(P<0.01);E、F组均分别显著高于D组(P<0.01);F组分别均高于E组(P<0.05).结论:Tp0751真核质粒菌影具有良好的免疫原性,在小鼠体内诱生了有效的系统和黏膜的体液应答以及系统细胞免疫应答;异源加免较同源加免免疫效果更好.
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梅毒螺旋体金属蛋白酶水解纤维蛋白原的活性研究
目的：研究梅毒螺旋体金属蛋白酶Tp0751对细胞外基质纤维蛋白原的水解能力，为深入研究TP的致病机制提供实验依据。方法采用两点法构建H198A突变型及H202A突变型Tp0751基因，分别构建野生型和突变型Tp0751原核载体进行诱导表达；体外实验检测Tp0751野生型Tp0751蛋白、H198A Tp0751突变型蛋白、H202ATp0751突变型蛋白对纤维蛋白原的降解活性。结果成功表达并纯化了野生型Tp0751蛋白、H198A Tp0751突变体蛋白、H202A Tp0751突变体蛋白，各蛋白相对分子量大小约为26kD；纤维蛋白原在与野生型Tp0751蛋白作用约24h后被完全水解；与 H198A Tp0751突变体蛋白作用约24 h 后部分水解，尚有部分未被降解；与H202A Tp0751突变体蛋白作用约24h后几乎不被水解。结论野生型Tp0751蛋白具有水解纤维蛋白原的作用；Tp0751蛋白水解纤维蛋白原的活性可能与金属蛋白酶HEXXH域相关，影响Tp0751蛋白对纤维蛋白原的降解的活性位点可能是202位的H而不是198位的H。
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梅毒螺旋体Tp 0751重组蛋白的表达及鉴定
目的 表达梅毒螺旋体粘附蛋白Tp 0751,纯化表达产物并对其抗原性进行鉴定. 方法通过生物信息学分析,去除Tp 0751信号肽序列,构建原核表达体并在大肠埃希菌(E.coli)R2566中进行诱导表达;Ni-NTA法纯化重组蛋白;蛋白质印迹法(WB)鉴定重组蛋白.结果 成功构建了PET-28a(+)/Tp 0751原核表达载体;经表达、纯化后获得了相对分子量约为26 kD的融合蛋白;经WB分析能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应. 结论重组表达的Tp 0751重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步研究Tp 0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定了基础.
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梅毒螺旋体粘附素Tp0751重组菌影的构建与鉴定
目的：构建梅毒螺旋体(Tp)粘附素Tp0751的重组大肠埃希菌菌影(E.coli bacterial ghosts,EBG),为深入评价其在抗Tp感染中的潜在免疫保护作用奠定基础。方法将含有噬菌体PhiX174裂解基因E的质粒pHH43转化E.coli DH5α,42℃温控诱导使其形成EBG并计算裂解效率,用琼脂糖DNA电泳和透射电镜( TEM)鉴定EBG。构建含有裂解基因盒E-box、膜锚定序列E′-linker及Tp0751目的基因的原核双表达重组质粒pET28a-E′-Tp0751-E-box,28℃诱导重组E.coli BL21表达Tp0751并用Western Blot鉴定；42℃诱导形成重组EBG(rEBG),计算裂解效率并用DNA电泳和TEM鉴定。结果构建的EBG裂解率为98.13％,DNA电泳未观察到DNA条带, TEM显示绝大部分细菌都裂解成缺乏胞浆成分的细胞空壳并保持活菌基本形态。 rEBG在28℃时高效表达重组Tp0751蛋白,且仅与梅毒患者血清特异性结合；42℃下其rEBG裂解率为96.37％,电泳和TEM鉴定结果与EBG的相似。结论成功构建表达Tp粘附素Tp0751的rEGB,其所表达目的蛋白具有良好免疫反应性。
